Faculté de chirurgie Dentaire Université Paris 5 Des glycosaminoglycannes à l’utilisation potentielle de polysaccharides en thérapie tissulaire Je remercie Marek haftek de son invitation qui me permet de vous présenter le thème de recherche que nous développons au sein du laboratoire de… Au sein de ce laboratoire nous dévellopons des polysaccharides mimant les propriétés des Glycosaminoglycannes afin de les utiliser dans les domaine de la santé et notemment de la régéneration tissulaire. Karim Senni

Matrice extracellulaire Matrice extracellulaire Cytokines, Facteurs de croissance, chémokines Matrice extracellulaire Matrice extracellulaire B Adhésion Prolifération Différentiation Dégradation Synthèse Migration Mort

Remodelage tissulaire Synthèse Dégradation Synthèses macromoléculaires Dégradations macromoléculaires Prolifération cellulaire Mort cellulaire

Remodelage pathologique Fibroses, ex: chéloïdes Synthèse Dégradation Fibroses, ex: chéloïdes

Remodelage pathologique Synthèse Dégradation Parodontite Ulcères chroniques cutanées Inflammations chroniques Cicatrisations retardées

Thérapies tissulaires Mobiliser au mieux les ressources in situ afin de parfaire la réparation voir la régénération tissulaire Recrutement des phénotypes cellulaires les plus aptes Aide à la reconstruction: matrice exogène, potentialisation des ressources tissulaires Arrêt des processus dégénératifs C’est dans la résolution de ces remodelage pathologique qu’intervient la thérapie tissulaire que nous définiront par…

Agir sur les acteurs du remodelage tissulaire Cellules résidentes: épithéliales, endothéliales, fibroblastes, ostéoblastes … Cellules inflammatoires: Macrophages, lymphocytes, PMN Facteurs de croissances (FGF, TGFb), cytokines (IL-1b, TNFa, IL-4), matrikines (endostatine, peptides de collagènes et d’élastine) Agents de clivages: protéases (MMPs, sérine protéases…), glycosidases, radicaux libres…

un contexte la matrice extracellulaire Matrice extracellulaire XXVII XI V III II I XXI, XXVI XIX, XX XIV, XVI IX, XII X VII IV XXVXXIIIXVIIXIII XVIII XV VI VII Fibrillaires FACITs réseau Filaments perlés fibrilles d’ancrage Multiplexines MACITs Collagènes Elastine Acide Hyaluronique Glycoprotéines Héparine HS CS DS KS Protéines fibreuses GAG Fibronectine Laminines Vitronectine Fibulines Fibrillines Nidogène Ténascine Ostéocalcine Ostéonectine FVW… Matrice extracellulaire Protéoglycannes Riches en Leucine Agrégats membrane basale surface cellulaire Intracellulaire Décorine Biglycane Fibromoduline… Versicane Agrecane Perlécane Agrine…. Syndécane Bétaglycane Glypicane... Serglycine K. Senni

Unités disaccharidiques répétitives des glycosaminoglycannes Dermatane sulfate (L-IdoA-D-GalNac) Héparine/Héparane sulfate (L-IdoA-D-GlcNAc) Acide hyaluronique (D-GlcU-D-GlcNac) Ces unités disaccharidiques répétitives sont les unités majoritaires par exemple 10% des acides uroniques de l’héparine sont des acides glucuroniques. Acide hyaluronique: seul GAG qui n’est jamais lié de manière covalente à une protéine, n’est jamais sulfaté. Héparine: sous forme protéoglycannique, quand intracellulaire (mastocytes, serglycine). Kératane sulfate (D-Gal-D-GalNAc) Chondroïtines sulfate (D-glcU-D-GalNAc)

Les glycosaminoglycannes [acide uronique (ose neutre)-hexosamine]n Unité disaccharidique répétée n fois: Sulfatation, Epimérisation => grande variabilité à l’intérieur d’une même chaîne Définit les interactions avec les autres acteurs du remodelage tissulaire: un code?

Protéoglycannes et Glycosaminoglycannes de la matrice extracellulaire

Protéoglycannes formant de grands agrégats matriciels. Acide Hyaluronique (HA) Chondroïtine sulfate Protéine de liaison Core protéique Agrécane: Cartilage, 1 centaine de CS quelques KS Versicane: Peau, Vaisseaux, 1 trentaine de CS PM: jusqu’à 106 Da Création d’espaces, rétention d’eau, circulation de petites molécules K. Senni Agrécane Roseman S 2001

Fragments d’acide hyaluronique Angiogenic oligosaccharides of hyaluronan induce multiple signaling pathways affecting vascular endothelial cell mitogenic and wound healing response Slevin et al J biol Chem 277 41046-41059 Fragments d’acides hyaluronique = Matrikine?

Petits protéoglycannes riches en leucine: Décorannes Décorines: 1 Chaîne CS ou DS en N-ter Structuration de la matrice collagénique Biglycane: 2 chaînes CS ou DS en N-ter Structuration du réseau élastique Fibromoduline: jusqu’à 4 à 5 chaînes KS tout au long du core protéique Séquestration du TGFb (core protéique) Liaison au FGFR et activation (décorine) Fibre de collagènes Décorine Chaîne GAG K. Senni

Les chaînes héparane sulfate participent à la structuration du réseau élastique Heparan Sulfate Depletion Within Pulmonary Fibroblasts: Implications for Elastogenesis and Repair Buszceck-Thomas et al J Cell Physiol 192:294–303 (2002)

Protéoglycannes de la membrane basale Caractère polyanionique Perlécane: CS/DS Filtration: glomérule rénal, barrière hémato-encéphalique Collagène XVIII: HS Crinopexie

Les protéoglycannes de la membrane cellulaire

Syndécane 4 et adhésion cellulaire: formation des contacts focaux d’adhésion b PKCa PIP2 Intégrine Syndécane 4 fibronectine Héparane sulfate Microfilaments D’après Tumova et al 2000

Protéoglycannes à Héparanes sulfate (syndécanes, glypicanes) et facteurs de croissance. Signal syndécane FGFR HS Membrane cellulaire FGF Des GAGs tels que l’héparine sont capables d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses, de certaines souches de fibroblastes gingivaux ou au contraire de stimuler celle de fibroblastes dermiques ou de de cellules endothéliales Les effets antiprolifératifs que nous observons pourrait être le reflet d’une action intracellulaire comme celles observée avec l’héparine ou des fucanes sur les CMLs. Par contre la stimulation de la prolifération, maximale aux concentrations en fucane les plus faibles, pourrait être causée par une potentialisation de certains facteur de croissance retrouvés dans le SVF. D’après Plotnikof et al 1999 K Senni

Interaction CD44 - protéases matricielles: migration cellulaire, remodelage tissulaire MMP-9 Zn V3 MMP-2 CD44 V3 isoform TIMP-2 MMP-7 MT1-MMP Heparan sulfate Membrane plasmique D’après Seiki Curr Op Cell Biol 2002

Focalisation de la MMP-7 (matrilysine) par le CD44v3 Implication dans la survie cellulaire CD44v3 V3 MMP-7 ErbB4 proHB-EGF Réplication, différentiation, survie cellulaire D’après Yu et al 2002

Les glycosaminoglycannes sont impliqués dans de nombreux mécanismes biologiques Crinopexie:potentialisation/protection des facteurs de croissance Contrôle de la protéolyse matricielle Structuration macromoléculaire/formation d’hydrogels Régulent avec la margination des cellules inflammatoires Des acteurs essentiels à la résolution des remodelages tissulaires

De bons candidats en thérapie tissulaire ACTIVITE ANTICOAGULANTE MAIS ORIGINE ANIMALE ACTIVITE ANTICOAGULANTE VOLUME/COÛT

Trouver des substituts I S’opposer au processus inflammatoire GAGs mimétiques I S’opposer au processus inflammatoire 3) Notre but à donc été la recherche de composés capables de s’opposer au processus inflammatoire tout en favorisant la régénération tissulaire. II Favoriser la régénération tissulaire.

Source: biotechnologie marine Exopolysaccharides bactéries extrêmophiles Fucanes

Polysaccharides GAGs mimétiques 2 Des structurants tissulaires, des biomatériaux 1 Des effecteurs pharmacologiques Héparane-mimétiques Hyaluronane-mimétiques

Héparane-mimétiques: Portrait robot - PM: 5 à 80 kDa - 20 à 40% sulfates/sulfonates Structure tridimensionnelle importante Souplesse de chaîne, embranchements

Fucanes Polysaccharides pariétaux des phéophycées 29% 6.3% 55.7% 16000 OSO3- Ac uronique L-fucose PM R= SO3-, fucose sulfaté ou acide uronique Ascophyllum nodosum

Exopolysaccharides des bactéries extrêmophyles abyssales (EPS) Yellow submarine Source hydrothermale profonde Écosystème extrême

Exopolysaccharides des bactéries extrêmophyles abyssales (EPS) Sélection Fermentation Production pilote

EPS d’Altéromonas infernus: GY 785 Sulfate GY 785 Dépolymérisation radicalaire GY 785 DR Sulfatation GY 785 DR0S Boisset C Brevet FR0406405

GY 785 DROS [SO3Na]  2 [4)-b-Glc-(14)-a-GalA-(14)-a-Gal-(1] 3  1 b-Glc-(1 6)-a-Gal -(14)-b-GlcA -(1 4)-b-GlcA 2 3   1 1 a-Glc a-Glc 4 6 40%, de sulfates, des acides uroniques, des oses neutres et une structure branchée PM  20-30 kDa Roger et al 2004

I S’opposer au processus inflammatoire

Inflammation Lymphocytes Les Glycosaminoglycannes peuvent aider à la résolution de la phase inflammatoire et à l’amorçage de la phase cicatricielle proprement dite. Inhibition de l’adhésion des leucocytes à la paroi endothéliale et donc de leur margination. Inhibition de la cascade du complément: libération des anaphilatoxine très diminuée. Inhibition de l’induction de certaines métalloprotéases matricielles par L’IL-1b (?). Inhibition directe de l’élastase leucocytaire: dégradation matricielle, activation des MMPs. - Réorganisation de la matrice extracellulaire: diminution de la migration des cellules inflammatoires. Liaisons TIMPs/MMPs favorisées. Potentialisation de l’action de certains facteurs de croissances (Crinopexie, Récepteurs de basse affinité). La destruction de la matrice extracellulaire libère d’une part les chaînes GAGs et d’autre part les facteurs de croissances K Senni

CIBLE 1 Recrutement des cellules inflammatoires: activités anti-complémentaires

Inhibition de la voie du complément Recrutement des cellules inflammatoires: activités anti-complémentaires Inhibition de la voie du complément Productions d’anaphylatoxines, d’opsonines Activation et Recrutement C5a C3a Cascade du complément C5 et C3 convertases

Activités anti-complémentaires des dérivés de l’EPS GY785 et du fucane Inhibition de l’activité cytolytique Courtois A Brevet FR0406405

Recrutement des cellules inflammatoires: inhibition de la margination CIBLE 2 Recrutement des cellules inflammatoires: inhibition de la margination

Recrutement des cellules inflammatoires: inhibition de la margination -Interférence avec les sélectines -Séquestration des chimiokines Rolling des leucocytes Leucocytes Membrane basales Protéases Glycosidases Protéases Glycosidases

Modèle « d’air pouch » chez la souris: chambre de chémo-attraction in vivo Leucocytes PMNs Fucane (10mg/kg/h) Fucane-- Dr CD Arréto: Faculté de Chirurgie Dentaire Montrouge, Données personnelles

Les protéases matricielles CIBLE 3 Les protéases matricielles

Les protéases matricielles 1 Sérine Protéases (PAs, plasmine, élastase leucocytaire, cathepsine G…) Inhibiteurs: Serpins 2 Métalloprotéases matricielles (MMPs): (collagénases, gélatinases, stromélysines…) Remodelage tissulaire: Physiologique: embryogénèse, angiogénèse, cicatrisation… Pathologique: Invasion tumorale, ulcèrations chroniques, parodontopathies, …

1 Sérine protéases Activation des MMPs Synergie Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire Elastase leucocytaire Cathepsine G Synergie Activation des MMPs

Inhibition de sérine protéases Substrat synthétique - Utilisation de fucane comme régulateur de la reconstruction des tissus conjonctifs. Senni et al 1997 Brevet FR2772618 Interaction avec lysines du site actif

Exemple: Les fibres élastiques cutanées sur substrat naturel? Exemple: Les fibres élastiques cutanées Coupes histologiques

Inhibition de l’élastase leucocytaire humaine (ELH) Témoin ELH Ep FE Ox Ela ELH/ Fucane (10µg/ml) -Epiderme, Dermes moyen et profond (Planche 1) La planche (1a) montre le réseau élastique d’une coupe témoin de peau. On peut y distinguer l’épiderme constitué d’un épithélium stratifié. Les fibres d’oxytalane sont parfaitement définies, parallèles à l’épithélium elles investissent les papilles dermiques. Ce réseau pré-élastique est lié aux fibres d’élaunines et aux fibres élastiques du derme moyen. Les fibres élastiques se démarquent bien du fond de la préparation, sont longues et bien individualisées. La planche (1b) montre une coupe contenant les mêmes structures que la coupe précédente, enzymisée par 5000 ng d’ELH. L’épiderme peut toujours être distingué mais nous pouvons observer un décollement de l’épithélium. Les fibres d’oxitalanes sont quasi inexistantes. Dans le derme moyen, nous pouvons observer quelques fibres très fragmentées alors qu’elles sont complètement digérées dans le derme profond. La planche (1c) est une coupe appartenant à la même série que les deux précédentes, sur laquelle a été déposée une solution de 5000ng d’ELH pré-incubée avec une solution à 10µg/ml de fucane Q2. L’épithélium épidermique est bien visible sans décollement. Les fibres d’oxytalanes sont bien visibles reliant le derme papillaire au derme moyen. Les fibres élastiques proprement dites sont bien visibles, en nombre important, elles occupent toute la surface du derme moyen et profond, même si elles semblent quelque peu fragmentées. La planche (1d) est une coupe appartenant toujours à la même série, sur laquelle a été déposée, cette fois ci une solution de 5000ng d’ELH pré-incubée avec une solution à 100µg/ml de fucane Q2. L’architecture du réseau élastique ne semble avoir subir aucune atteinte. Comme dans le témoin, les fibres pré-élastiques (oxytalane, élaunine) et les fibres élastiques sont bien individualisées et ne présentent pas de fragmentation. ELH / Fucane (100µg/ml)

Inhibition de l’élastase leucocytaire humaine (ELH) par un fucane Témoin ELH Lu LE ELH/fucane (1µg/ml) - Réseau vasculaire du derme moyen et profond (planche 2) La série de documents présentée ci-après se situe au niveau d’une artériole du derme moyen.   La planche (2a) est une coupe témoin sur laquelle ont retrouve l’artériole étudiée. Autour de la lumière vasculaire, des lames élastiques concentriques sont organisées tandis que le derme profond présente de nombreuses fibres élastiques. La planche (2b) est une coupe enzymisée par 2000ng d’ELH situé au niveau de la même artériole. Nous avons été incapables de présenter le document à 5000ng, car le tissu conjonctif est tellement endommagé que le repérage de la zone d’intérêt s’est révélé impossible. Sur ce document, aucun élément n’a pu être coloré spécifiquement, preuve d’une hydrolyse quasi totale du réseau élastique de cette zone. La planche (2c) montre la même zone comprenant l’artériole étudiée sur laquelle à été déposé une solution de 5000ng d’ELH pré-incubée avec une solution à 1µg/ml de fucane Q2. L’artériole, invisible sur la coupe enzymisée, se distingue du fond de la préparation. Quelques fibres fragmentées appartenant aux lames élastiques de l’artériole sont visibles et permettent le repérage de cette artériole. Aucune fibre n’est visible dans le derme entourant cette artériole. La planche (2d) est une zone se situant sur une coupe sur laquelle à été déposé une solution de 5000ng d’ELH pré-incubée avec une solution à 100µg/ml de fucane Q2. Le réseau élastique observé est quasiment identique dans sa structuration au réseau élastique présent dans la coupe témoin. ELH/Fucane (100µg/ml)

Métalloprotéases matricielles (MMPs) Cellules résidentes TNFa IL-1b Pro-MMPs MMPs Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire

Les fucanes inhibent la sécrétion de la gélatinase A par des fibroblastes dermiques en culture

Les fucanes inhibent l’induction par l’IL-1b de la MMP-3 sécrétée par des fibroblastes dermiques en culture

Les héparane-mimétiques marins: des anti-inflammatoires non conventionnels? Lymphocytes Les Glycosaminoglycannes peuvent aider à la résolution de la phase inflammatoire et à l’amorçage de la phase cicatricielle proprement dite. Inhibition de l’adhésion des leucocytes à la paroi endothéliale et donc de leur margination. Inhibition de la cascade du complément: libération des anaphilatoxine très diminuée. Inhibition de l’induction de certaines métalloprotéases matricielles par L’IL-1b (?). Inhibition directe de l’élastase leucocytaire: dégradation matricielle, activation des MMPs. - Réorganisation de la matrice extracellulaire: diminution de la migration des cellules inflammatoires. Liaisons TIMPs/MMPs favorisées. Potentialisation de l’action de certains facteurs de croissances (Crinopexie, Récepteurs de basse affinité). La destruction de la matrice extracellulaire libère d’une part les chaînes GAGs et d’autre part les facteurs de croissances K Senni

II Favoriser la régénération tissulaire Signal syndécane FGFR Héparane sulfate Membrane cellulaire FGF 3) Notre but à donc été la recherche de composés capables de s’opposer au processus inflammatoire tout en favorisant la régénération tissulaire.

Prolifération de fibroblastes dermiques en culture bidimensionnelle GY785 DROS Fucane Senni K

Dérivés d’EPS, fucanes et prolifération cellulaire FGF Dérivés d’EPS, fucane FGFR Ex: Fibroblastes Membrane cellulaire FGF Forte concentration en polysaccharides: prolifération Signal Des GAGs tels que l’héparine sont capables d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses, de certaines souches de fibroblastes gingivaux ou au contraire de stimuler celle de fibroblastes dermiques ou de de cellules endothéliales Les effets antiprolifératifs que nous observons pourrait être le reflet d’une action intracellulaire comme celles observée avec l’héparine ou des fucanes sur les CMLs. Par contre la stimulation de la prolifération, maximale aux concentrations en fucane les plus faibles, pourrait être causée par une potentialisation de certains facteur de croissance retrouvés dans le SVF. Faible concentration en polysaccharides: prolifération K Senni

Sélection phénotypiques Résolution des pathologies fibrotiques ? Myofibroblaste a SMA positif Fibroblaste a SMA négatif Lors de certains types de fibroses il y persistance d’un phénotype fibroblastique sécrétoire: le myofibroblaste

Sélection de sous populations fibroblastiques par le GY785DROS Immuno-détection de l'a actine des muscles lisses dans des cultures fibroblastiques en cours de prolifération (7ème jours) GY785 DROS a f e d c b TEMOIN La stimulation de la prolifération cellulaire s'accompagne d'une sélection des sous populations non myofibroblastiques Observation de sous populations myofibroblastiques dans une culture de fibroblastes dermiques: (a, c et e) GY785 DRS (10µg/ml) (b, d et f) Témoin. -Grandissements: a et b  13; c et d  26, e et f  52 -Immunodétection de l' a-SMA et contre-coloration à l'hémalun) . Myofibroblaste isolé, Brevet FR0406405 Senni K

En présence d’une matrice extracellulaire? Tissu conjonctif reconstruit (fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses)

Prolifération au sein d’un derme reconstruit GY785 DROS 10µg/ml Gueniche F Brevet FR0406405

Hyaluronane-mimétiques : Portrait robot - PM  1000 kDa Viscosité

L’acide hyaluronique: un biomatériau Couverture épidermiques des plaies chroniques

HE 800 = Hyaluronate mimétique? L’exopolysaccharides de Vibrio diabolicus HE 800 = Hyaluronate mimétique? Acide hyaluronique: PM = 500 à 1000 kDa [( (3)D GlcNac-(b1-4) D-GlcA b (1)]n HE800: PM = 800kDa [ (3) D GlcNAc b (1-4) D GlcA b (1-4) D GlcA b (1-4)-D-GalNAc a (1)]n

Cicatrisation osseuse in vivo A New Bone-Healing Material: A Hyaluronic Acid-Like Bacterial Exopolysaccharide Zanchetta et al Calcif Tissue Int (2003) 72:74–79

Chimie, angiogenèse, ingénierie et régénération tissulaire Fischer AM U765 LBMM Guézennec J EA 2496 Godeau G -Biotechnologie marine -Thérapies tissulaires GdR Exopolysaccharides bactériens Chimie, angiogenèse, ingénierie et régénération tissulaire -Valorisation industrielle

Faculté de Chirurgie Dentaire Biotechnologie et Molécules marine Gaston Godeau Myriam Yousfi Farida Gueniche Grégory Korb Florence Fioretti Sylvie Igondjo-Tchen Karim Senni Biotechnologie et Molécules marine Les bretons Jean Guézennec Sylvia Colliec-Jouault Claire Boisset Corinne Sinquin Jacqueline Rastikol Anthony Courtois Patrick Durand