Quelques conseils pratiques: Préparation des biopsies Conditionnement pour l’envoi des échantillons Nathalie Quellard, Sihem Kaaki, Corinne Lacombe, Julie Godet Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques Unité de Pathologie Ultrastructurale,CHU Poitiers Paris, 16 janvier 2015 Centre de référence Amylose AL et autres maladies par dépôts d’Ig monoclonales
Intérêt d’une bonne préparation Interprétation fiable et rigoureuse Diagnostic assuré Mise en place d’un traitement Techniques coûteuses
Réalisation des biopsies Prélèvement au lit du patient - Microscopie optique: Duboscq Brazil - Immunofluorescence: Azote liquide - Microscopie électronique Glutaraldéhyde Plonger le plus rapidement possible les fragments biopsiques dans les liquides de conservation
Microscopie photonique Service AnaPath Fixation - Duboscq Brazil (éthanol, ac.acétique, formol, ac.picrique) - 6-8H à 20°C ou 24H à 4°C - Conservation formol tamponné 10% Coloration Topographie générale des dépôts Détection des dépôts amyloïdes HES 3µm Rouge congo 5µm Lumière polarisée
Typage des dépôts: Immunofluorescence Mauvais rendement sur bloc paraffinéPrélèvement congelé Système révélateur Anticorps primaire Antigène Echantillon Epitope Vaste gamme d’anticorps: IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, ss-classes IgG, TTR, SAA… Cryotube + support carton Support de congélation + cryocolle Plonger rapidement dans l’azote liquide
Biopsie de graisse sous cutanée Rappels: - Possibilité de transport en sérum physiologique à 4 °C - Si rouge Congo réalisé au labo: Coupes de 7 µm d’épaisseur ( Rouge Congo et IF) Ne jamais fixer les prélèvements en acétone
Microscopie électronique (Unité de Pathologie Ultrastructurale et Expérimentale Service Anatomie et Cytologie pathologiques ) Localisation précise Organisation Diamètre et structure des fibrilles (amyloïdes ou microtubulaires) 2 possibilités: Prélèvement Fixation Inclusion Bonne qualité de l’échantillon Fiabilité de l’interprétation
Fixation La fixation doit être réalisée rapidement après exérèse Vide poussé Impact électronique Nécessité d’une bonne fixation Morphologie et structure préservées Pas de destruction irréversible Processus enzymatiques immobilisés Autolyse dès 1ères sec après exérèse La fixation doit être réalisée rapidement après exérèse
Comment fixer? Conservation à -80°C jusqu’à l’envoi en carboglace Fixation physique: Cryofixation - Congélation rapide dans l’azote liquide Conservation à -80°C jusqu’à l’envoi en carboglace
Comment fixer? Fixation chimique : glutaraldéhyde 2-4% - Réticulation du gel protéique - Inhibition de l’autolyse Immersion rapide dans le fixateur Découpe dans le fixateur Fragment < 2 mm3 Conservation dans le fixateur à 4°C et min 1H La fixation chimique consiste à reconstituer artificiellement le gel protéique du vivant très hydraté (75% à 95% d'eau) afin de rendre les molécules d'un échantillon insolubles dans l'eau comme dans les solvants organiques, et ainsi bloquer les systèmes enzymatiques pour éviter toute modification structurelle ultérieure de l'échantillon. En effet, l'échelle très fine à laquelle se font les observations en microscopie électronique impose de conserver, sans modification, les structures correspondant à l'état vivant. Le glutaraldéhyde (COH(CH2)3COH) est un dialdéhyde qui interagit rapidement avec les protéines. Il stabilise les structures en créant des ponts artificiels entre les protéines et des groupements animés libres: Avec deux groupes aldéhydes séparés par une chaîne flexible, HCO-(CH2)3-CHO, il possède un grand potentiel de création de ponts, qui peuvent apparaître grâce aux deux groupes et à des distances variables Composé d’oligomères de grande taille pénètre donc lentement
Fixateur utilisé en ME Glutaraldéhyde: COH(CH2)3COH - 2 aldéhydes libres autour d'une chaîne carbonée aliphatique - Ponts méthylène entre fonction amine des protéines et aldéhyde - Fixation rapide mais pénétration lente (1mm/h) - Fixation +++protéines, chromatine, acides nucléiques Il est très important d'utiliser un glutaraldéhyde "EM grade" Composé uniquement de monomères, les seuls de taille suffisamment réduite pour pénétrer rapidement le tissu (les autres formules sont destinées à tanner le cuir !)
Préparation du fixateur Protocole de préparation sur le site du CR: www.cr.amylose-al.fr - Respect du milieu intérieur cellulaire: Composition de la solution contenant le fixateur: -Osmolarité (saccharose, NaCl) -pH ( tamp. phosphate, tamp.cacodylate) - Concentration : entre 2 et 4% - Quantité: 10 fois le volume des pièces à traiter - Volume des pièces à fixer : 1 à 2 mm3 - Température de fixation : 4°C 1H minimum - Qualité du fixateur : date de péremption Rapidité de la fixation Délai entre l’exérèse et la fixation < 30 secondes
Effet de la pression osmotique dans le tampon de préparation des fixateurs Solution hypertonique Solution hypotonique La solution fixatrice doit être osmotiquement équilibrée par rapport au milieu cellulaire du tissu étudié
Bonne fixation Pb osmolarité Fixation tardive Mauvaise congélation MO
Séjour prolongé dans le tampon mitochondrie noyau Séjour prolongé dans le tampon Fixation tardive
Envoi du fixateur possible par courrier avant biopsie 8nm Conservation une quinzaine de jours à 4°C dans le glutaraldéhyde Sans altérations ultrastructurales (pas de surfixation) Envoi du fixateur possible par courrier avant biopsie
Biopsie perpendiculaire à l’axe de coupe Inclusion Permet la confection de coupes ultrafines (50-80nm) Faible pouvoir de pénétration des électrons dans la matière Evite toute évolution du tissu sous l’action des électrons Disposition de la biopsie dans le moule Axe de coupe Biopsie perpendiculaire à l’axe de coupe
Conditionnement des biopsies pour l’envoi Biopsie fixée au glutaraldéhyde: -Envoi dans cryotube rempli de fixateur envoi à 4°C Biopsie congelée: - Envoi en carboglace Mettre suffisamment de carboglace Eviter le week-end Eviter le colissimo
www.cr.amylose-al.fr