CHAPITRE 1 : STRUCTURE DES ACIDES NUCLÉIQUES I. DÉFINITION. II. LES NUCLÉOTIDES. III. LES ACIDES NUCLÉIQUES. IV. LES ADN. V. LA CONFORMATION DES ADN.

Chapitre 1 STRUCTURE DES ACIDES NUCLÉIQUES I. DÉFINITION On peut distinguer deux grands types: - les acides désoxyribonucléiques (ADN).Dans le noyau essentiellement - les acides ribonucléiques (ARN). Dans le cytoplasme. Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont des macromolécules et comportent des sous-unités appelées nucléotides.

II. LES NUCLÉOTIDES II.1. Définition. Un nucléotide comporte trois composants: de l’acide phosphorique, un ose et une base. Les bases sont classées en bases pyrimidiques et en bases puriques. Les principales bases pyrimidiques sont: l’uracile, la cytosine et la thymine. Les principales bases puriques sont l’adénine et la guanine.

Les constituants des acides nucléiques Bases puriques et pyrimidiques

Sucres : ribose et désoxyribose

Les nucléosides ARN ADN

Les nucléotides

La structure secondaire de l'ADN : appariements entre les bases

Paire de bases AT, vue de profil Paire de bases AT, vue de dessus

L’ose: deux types d’oses sont présents, le ribose et le 2’-désoxyribose. Ces deux sucres sont des oses avec cinq atomes de carbone ou pentoses. On les numérote avec des chiffres accompagnés de l’indication prime pour éviter des confusions avec les numérotations des bases. Le 2’-désoxyribose est un ribose dans lequel il manque un OH en 2’ (remplacé par un H).

II.2. Les liaisons dans les nucléotides. La liaison ose-base. La liaison ose-base est une liaison glycosidique, appelée b-osidique. Elle se forme par élimination d’une molécule d’eau entre la base purique ou pyrimidique et l’OH situé en C1 de l’ose. Les liaisons glycosidiques sont de deux types: soit une conformation anti, soit une conformation syn. Dans le type anti, le sucre et la base sont éloignés l’un de l’autre. A l’opposé, dans le type syn, la base et l’ose sont proches l’un de l’autre.

II.3. Nomenclature des principaux nucléotides. Les nucléotides à base pyrimidique, par exemple avec la base uracile, le nucléoside et le nucléotide correspondants sont appelés respectivement uridine (terminaison idine) et acide uridylique (idylique). L’appellation est complétée si l’ose est un désoxyribose en faisant précéder l’abréviation du nucléotide par la lettre «d» (pour désoxy). Les nucléotides à base purique, par exemple avec la base adénine, le nucléoside et le nucléotide correspondants sont appelés respectivement adénosine (terminaison ine) et acide adénylique (terminaison ylique).

TABLEAU I. Nomenclature des principaux nucléotides. BASE NUCLEOSIDE NUCLEOTIDE ARN monophosphate ADN monophosphate CODE adénine adénosine acide adénylique AMP dAMP A guanine guanosine acide guanylique GMP dGMP G cytosine cytidine acide cytidylique CMP dCMP C thymine thymidine acide thymidylique   dTMP T uracile uridine acide uridylique UMP U

III. LES ACIDES NUCLÉIQUES III.1. Les liaisons reliant les nucléotides. les nucléotides sont liés entre eux par des liaisons ester (liaison phosphodiester entre l’extrémité 5’ phosphate et l’extrémité 3’OH). -

La structure primaire de l'ADN : la liaison phosphodiester

III.2. Sens de lecture d’un acide nucléique. Par convention, on lit toujours un acide nucléique dans le sens de l’extrémité 5’ (comportant en règle un groupement phosphate) vers l’extrémité 3’ qui possède un OH libre. La séquence des bases d’un ADN par convention sera écrite soit dans le sens vertical ou dans le sens horizontal en précisant les extrémités 5’ et 3’ et on indique seulement les bases correspondantes (A, T, G ou C). Exemple : 5’ -ACGTAAC-3’

IV.1. Constituants de l’ADN: ose, bases et chaînes de nucléotides. IV. LES ADN IV.1. Constituants de l’ADN: ose, bases et chaînes de nucléotides. Les ADN présentent plusieurs caractéristiques propres et qui les opposent aux ARN: L’ose: le 2’-désoxyribose (remplacé par le ribose dans les ARN). Les bases: A, C, G et T, soit deux bases puriques (A et G) et deux bases pyrimidiques (C et T). Dans les ARN, T est remplacé par U (uracile). Les polymères de nucléotides: La molécule d’ADN est constituée en règle de deux chaînes (ou brins) de nucléotides. Les molécules d’ARN sont le plus souvent sous forme d’un seul brin.

IV.2. Les principales caractéristiques des chaînes d’ADN - Antiparallèles: Les deux brins d’une molécule d’ADN sont disposés dans des directions opposées. Un brin est orienté dans une direction 5’à 3’, et le second brin sera parallèle au premier et dans la direction inverse 3’à 5’. - Complémentaires: L’appariement des bases des deux brins d’une molécule d’ADN se fait suivant la règle de complémentarité: A apparié avec T, C apparié avec G. - Hélicoïdales: Dans l’espace les deux chaînes présentent une configuration hélicoïdale. Elles s’enroulent autour d’un axe imaginaire pour constituer une double hélice à rotation droite (dans les formes A et B de l’ADN par exemple) ou plus exceptionnellement à rotation gauche (dans la forme Z de l’ADN).

Les formes de l’ADN. La forme B de l’ADN est la forme biologique la plus importante. Elle correspond à la forme décrite en 1953 par Crick et Watson. Les caractéristiques de l’hélice sont les suivantes: environ 10 paires de bases par tour de spire, le pas de l’hélice est de 3,4 nm et le diamètre de l’hélice est de 2,4 nm. Dans les cellules, la forme de l’hélice est un peu plus compacte et comporte environ 10,5 paires de bases par tour de spire.

3,4 nm 10 paires de base

Dans la forme B, les bases puriques et pyrimidiques sont à l’intérieur de l’hélice, les groupements phosphates et les désoxyriboses sont à l’extérieur. Les plans des bases sont perpendiculaires à l’axe de l’hélice. Les plans des oses sont presque perpendiculaires à ceux des bases. Une caractéristique importante de la forme B de l’ADN est la présence de deux types de sillons appelés sillon majeur (1,2 nm de large) et sillon mineur (0,6 nm de large).

IV.3. Propriétés physico-chimiques de l’ADN . Si on chauffe une solution d’ADN, à une certaine température, les liaisons hydrogène qui assurent la cohésion des deux brins appariés se rompent, les deux brins se séparent, on parle improprement de fusion de l’ADN caractérisée par la température de fusion (ou Tm). L’ADN est dénaturé. Cette dénaturation est cependant réversible dans certaines conditions, les deux brins peuvent se réassocier suivant les règles de complémentarité.

-La présence des bases puriques et pyrimidiques permet aux acides nucléiques (ADN et ARN) d’absorber dans l’ultra-violet (UV) à 260 nm. -Les protéines absorbent un peu à 260 nm, mais surtout à 280 nm. -Cette absorption dans l’UV permet de doser les acides nucléiques et d’estimer la contamination par les protéines lors de la purification des acides nucléiques.

Chapitre 2 :LES ACIDES RIBONUCLÉIQUES (OU ARN) I. LES CARACTÉRISTIQUES GÉNÉRALES. II. LES DIFFÉRENTS TYPES D’ARN. III. LES ARN RIBOSOMIQUES (rARN). III.1. Les rARN des procaryotes. III.2. Les rARN des eucaryotes. III.3. Rôle des rARN. IV. LES ARN DE TRANSFERT (tARN). IV.1. Structure des tARN. IV.2. Rôle des tARN. V. LES ARN MESSAGERS (mARN). VI. LES PETITS ARN NUCLEAIRES (snRNA).

I : CARACTÉRISTIQUES GÉNÉRALES Les ARN sont caractérisés par : - L’ose, le ribose remplace le 2’-désoxyribose présent dans les ADN.  - Les bases pyrimidiques et puriques rencontrées sont: A, C, G et U (cette dernière est remplacée par T dans les ADN). - Une seule chaîne nucléotidique (au lieu de deux dans les ADN). Cette unique chaîne est plus courte que les chaînes d’ADN.

II. LES DIFFÉRENTS TYPES D’ARN. Les cellules contiennent essentiellement quatre types d’ARN: Les ARN ribosomiques (ou rARN). Les ARN de transfert (ou tARN). Les ARN messagers (ou mARN). Les ARN nucléaires de petite taille (ou snRNA)(ou small nuclear RNA et les ARN cytoplasmiques de petite taille (ou scRNA) (ou small cytoplasmic RNA)  Dans la cellule, les rARN sont les plus abondants (au moins 80% de l’ensemble des ARN de la cellule) et les snRNA les moins abondants.

III :LES ARN RIBOSOMIQUES Les ribosomes sont des organites intra-cellulaires situés dans le cytoplasme (mais on en trouve également dans les mitochondries) et qui sont l’usine de fabrication des protéines de la cellule. On peut distinguer les rARN des procaryotes (E. coli) et les rARN des eucaryotes.

Ribosomes

III.1. Les rARN des procaryotes (E. coli). Les ribosomes dits 70 S sont formés de deux sous-unités: - une grande sous-unité (50 S) - une petite sous-unité (30 S). Chaque sous-unité comporte des protéines dites protéines ribosomales (ou r-protéines) et des rARN. Ainsi,   - la sous-unité 50 S contient deux rARN dits 5 S et 23 S avec au moins 34 protéines - la sous-unité 30 S ne contient qu’un rARN dit 16 S avec au moins 21 protéines.

III.2. Les rARN des eucaryotes. Chez les eucaryotes, les ribosomes sont plus gros (80 S) avec également une structure à deux sous-unités (40 S et 60 S). La sous-unité 60 S contient trois rARN différents (5 S, 5,8 S et 28 S) La petite sous-unité 40 S ne contient qu’un seul rARN (18 S). Le nombre de protéines ribosomales à l’intérieur de chaque sous-unité est plus important que chez les procaryotes.

III.3. Rôle des rARN. Les rARN jouent un rôle essentiel dans la structure et le maintien de l’intégrité des ribosomes en association avec les protéines ribosomales.

IV : LES ARN DE TRANSFERT (tARN). Les tARN sont les vecteurs qui vont transférer les acides aminés jusqu’à l’usine ribosome où s’effectue la synthèse protéique.

IV.1. Structure des tARN. La structure spatiale des tARN.

La structure spatiale des tARN. Les tARN sont constituées d’une 100 de nucléotides (tARN sous forme de trèfle). Au niveau de l'extrémité 3’-OH existe trois nucléotides caractéristiques -C-C-A-3’-OH, c’est par cette extrémité que sera fixé l’acide aminé L’anticodon qui correspond à un groupe de trois nucléotides (ou triplet) situé sur une boucle du tARN. Ce triplet s’apparie avec le codon correspondant présent sur l’ARN messager, par des liaisons hydrogènes Enfin, l’extrémité 5’ des tARN comporte un groupement phosphate.

Les tARN jouent un rôle capital dans la biosynthèse protéique IV.2. Rôle des tARN. Les tARN jouent un rôle capital dans la biosynthèse protéique (voir cours plus loin)

V. LES ARN MESSAGERS (mARN). Les ARN messagers (ou mARN) constituent le support essentiel de l’information génétique entre l’ADN et le ribosome où s’effectuera la synthèse protéique.   Leur durée de vie est très courte ( pour une bactérie, la durée de vie d’un mARN est de quelques minutes). Les mARN sont très rapidement synthétisés et dégradés. Ils sont formés d’une seule chaîne de nucléotides Cette chaîne comporte une succession de triplets nucléotidiques. Chaque triplet nucléotidique constitue un codon spécifique d’un acide aminé donné.

VI. LES PETITS ARN NUCLEAIRES. Les petits ARN nucléaires (ou snRNA) sont présents dans le noyau des cellules et sont impliqués dans certaines étapes de la transcription, c’est-à-dire la copie de l’ADN en ARN messager. Ces snRNA sont présents sous forme de particules ribonucléoprotéiques qui sont appelées snRNP : small nuclear ribonucleoparticles. Dans le cytoplasme, on peut retrouver des petits ARN (ou scRNA, c=cytoplasmic) qui existent également sous forme de particules ribonucléoprotéiques (appelées scRNP : small cytoplasmic ribonucleoprotein particles)

CHAPITRE 3 : LES OUTILS ENZYMATIQUES UTILISÉS EN BIOLOGIE MOLÉCULAIRE COUPURE DES ADN PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION I. GÉNÉRALITÉS. II. SÉQUENCES D’ADN RECONNUES PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION. III. ORIGINE DES ENZYMES DE RESTRICTION. IV. NOMENCLATURE DES ENZYMES DE RESTRICTION. V. TYPES DE COUPURES REALISÉES PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION. VI. LES CLASSES D’ENZYMES DE RESTRICTION. VII. MÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTION ET INACTIVATION DES ENZYMES DE RESTRICTION. VIII. UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION.

I. GÉNÉRALITÉS. -Les enzymes de restriction clivent l’ADN dans des sites particuliers reconnus par l’enzyme. -Le nombre d’enzymes de restriction est de l'ordre de centaines Chaque enzyme reconnaît une séquence d’ADN qui lui est spécifique. -Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique. -Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).

II. SÉQUENCES D’ADN RECONNUES PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION. - Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des séquences dites palindromiques. Ce sont des séquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’à3’ (gauche-droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’à3’). - Ces séquences palindromiques sont constituées de 4 ou 6 paires de bases.

5’-A-A-G-C-T-T-3’ 3’-T-T-C-G-A-A-5’

Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries. Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Les bactéries fabriquent des enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers.

IV. NOMENCLATURE DES ENZYMES DE RESTRICTION. Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4). - La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite en majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. - La seconde lettre et la troisième lettre (en minuscules) correspondent à l’espèce de la bactérie d’où l’enzyme est extraite. - Une quatrième lettre écrite en majuscule correspondant à la souche bactérienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de ces enzymes. Exemple : Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB

Exemples:   Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des mêmes sites spécifiques, on les appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique des fragments dont les extrémités sont différentes.

V. TYPES DE COUPURES REALISÉES PAR LES ENZYMES DE RESTRICTION. Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure à bouts francs et la coupure à bouts collants. La coupure à bouts francs aboutit à une coupure au milieu de la séquence palindromique. La coupure à bouts collants (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se fait de part et d’autre du centre de symétrie.

VI. LES CLASSES D’ENZYMES DE RESTRICTION. La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire présentent un site de reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de reconnaissance, ce sont des enzymes de type II. Certaines bactéries possèdent d’autres types d’enzymes de restriction.  Les enzymes de type I Ces enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000 paires de bases plus loin. Les enzymes de type III présentent également un site de reconnaissance mais coupent une vingtaine de nucléotides plus loin.

5’-A-A-G-C-T-T-3’ 3’-T-T-C-G-A-A-5’ VII. MÉTHYLATION DES SITES DE RESTRICTION ET INACTIVATION DES ENZYMES DE RESTRICTION L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d’être repérés par les enzymes de restriction que possèdent la  bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de modification de l’ADN bactérien interviennent. Ces enzymes de modification sont des méthylases bactériennes (ou enzymes de méthylation). La méthylation de la cytosine (sur le carbone 5) ou de l’adénine (sur l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une inactivation de l’enzyme de restriction correspondante. Prenons l’exemple de l’enzyme de restriction Hind III qui reconnaît la séquence spécifique (et palindromique) suivante: 5’-A-A-G-C-T-T-3’ 3’-T-T-C-G-A-A-5’

La méthylation de l’adénine (représentée sur le schéma associée avec un cercle) aboutit à une absence de reconnaissance de ce site spécifique par l’enzyme Hind III et donc à une absence de coupure enzymatique: 5’-Å-A-G-C-T-T-3’ 3’-T-T-C-G-A-Å-5’

VIII. UTILISATIONS DES ENZYMES DE RESTRICTION. Les enzymes de restriction permettent de fractionner l’ADN en multiples fragments susceptibles d’être séparés par les techniques d’électrophorèse.  Les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour préparer un fragment d’ADN d’un gène donné (insert) à être inséré dans un vecteur comme un plasmide.  Les enzymes de restriction sont utilisées couramment pour rechercher des mutations dans le génome.  Une notion importante pour l’utilisation des enzymes de restriction est la notion d’enzymes compatibles. Deux enzymes de restriction sont dites compatibles quand elles génèrent après digestion des fractions aux extrémités cohésives complémentaires. Ces fragments peuvent être facilement ligaturés.

CHAPITRE 4 : LES OUTILS ENZYMATIQUES AUTRES QUE LES ENZYMES DE RESTRICTION I. LES ENZYMES COUPANT L’ADN. I.1. La DNase. I.2. La nucléase S1. II. LES ENZYMES ASSURANT LA LIGATURE. II.1. Les ligases. III. LES ENZYMES ENLEVANT OU AJOUTANT DES GROUPES PHOSPHATES. III.1. Les enzymes enlevant des groupes phosphates. III.2. Les enzymes ajoutant des groupes phosphates. IV. LES ENZYMES RECOPIANT LES ACIDES NUCLÉIQUES. IV.1. Propriétés générales. IV.2. Les enzymes recopiant un ADN en ADN. IV.2.1. L’ADN polymérase I (E. coli) et le fragment de Klenow. IV.2.2. La séquenase. IV.2.3. La Taq polymérase. IV.3. Les enzymes recopiant un ARN en un ADN. IV.4. Les enzymes recopiant un ADN en un ARN.

Chapitre 4 LES OUTILS ENZYMATIQUES AUTRES QUE LES ENZYMES DE RESTRICTION I. LES ENZYMES COUPANT L’ADN. I.1. La DNase.

L La DNase utilisée au laboratoire est extraite du pancréas de bovin. -          I.1. La DNase. L La DNase utilisée au laboratoire est extraite du pancréas de bovin. -  Il s’agit d’une endonucléase qui coupe l’ADN double brin (mais aussi l’ADN simple brin). Elle conduit à des coupures tout à fait au hasard, sans reconnaissance d’un site spécifique (ce qui la distingue des enzymes de restriction).   On obtient des fragments de tailles variées (ou oligonucléotides) qui possèdent en leur extrémité 5’ un groupement phosphate. Cette enzyme est sensible à des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+).

I.2. LA NUCLÉASE S1. Cette enzyme extraite d’un champignon, n’attaque que l’ADN simple brin. Elle n’attaque pas en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN. 1.3 L'EXONUCLEASE III. Cette enzyme catalyse l'hydrolyse séquentielle des nucléotides d'un ADN 3' --->5' à partir d'une extrémité 3'OH libre.

II. LES ENZYMES ASSURANT LA LIGATURE   II.1. LES LIGASES. Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement phosphate en 5’ et un groupement OH en 3’ et ceci en présence d’ATP. Elles peuvent effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN avec bouts francs ou des bouts collants (ou extrémités cohésives). Elles sont extraites de bactéries.

III. LES ENZYMES ENLEVANT OU AJOUTANT DES GROUPES PHOSPHATES. III.1. ENZYMES ENLEVANT DES GROUPES PHOSPHATES. Ces enzymes sont appelées phosphatases. Les phosphatases alcalines sont actives à pH alcalin. Elles permettent d’enlever le groupement phosphate situé en 5’ d’une chaîne d’ADN. Elles sont extraites de bactéries ou d’origine animale (intestins). Elles sont utilisées pour préparer de l’ADN recombinant.

Ces kinases sont extraites de bactéries. III.2. ENZYMES AJOUTANT DES GROUPEMENTS PHOSPHATES. Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP. Dans cette molécule d’ATP, le phosphate fixé est celui situé en position gamma (position la plus externe) de la molécule d’ATP. Le groupement phosphate est fixé à l’extrémité 5’ d’un ADN préalablement déphosphorylé. Ces kinases sont extraites de bactéries.

IV. LES ENZYMES RECOPIANT LES ACIDES NUCLÉIQUES.   IV.1. PROPRIÉTES GÉNÉRALES. - Les enzymes recopiant aussi bien une chaîne d’ADN ou d’ARN ont les propriétés générales suivantes: -     - Elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’à3’. - - Cette synthèse s’effectue de manière complémentaire et antiparallèle. - - Elles nécessitent la présence de nucléosides triphosphates (NTPs) ou de désoxynucléosides triphosphates (dNTPs).

IV.2. LES ENZYMES RECOPIANT UN ADN EN ADN. - Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN dépendantes. Elles ne sont pas capables de synthétiser le brin nouveau d’ADN sans la présence d’une amorce d’acide nucléique.

Toutes les ADN polymérases possèdent les caractéristiques suivantes Elles ont besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH libre.  La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée dans le sens 5’à3’. La chaîne nouvelle est complémentaire de la chaîne matrice d’ADN et antiparallèle.

IV.2.1. L’ADN POLYMÉRASE I (E. coli) - l’ADN polymérase I qui est extraite d’E. coli. possède des propriétés polymérasiques, mais aussi des propriétés exonucléasiques. ( Il est important de préciser que les exonucléases peuvent couper les nucléotides un par un à partir d’une chaîne polynucléotidique avec une spécificité soit de l’extrémité 5’ (coupure 5’à3’), soit de l’extrémité 3’ (coupure 3’à5’).   - L’ADN polymérase I possède les deux activités exonucléasiques: 5’à3’ et 3’à5’. Cette enzyme est constituée par une seule chaîne polypeptidique.

on utilise souvent une enzyme préparée à partir de l’ADN polymérase I qui est appelée fragment de KLENOW. Cette enzyme ne possède plus d’activité exonucléasique 5’à3’, il reste les propriétés polymérasiques et les propriétés exonucléasiques 3’à 5’. L’activité 3’à5’ permet à l’enzyme au cours d’une synthèse d’un fragment d’ADN de contrôler si l’appariement de la base qui vient d’être ajoutée est conforme aux règles de complémentarité. Cette remarquable activité exonucléasique 3’à 5’ est encore appelée la fonction d’édition de l’enzyme.

IV.2.2. LA SÉQUENASE.   Cette enzyme est d’origine bactérienne mais elle ne possède plus d’activité 3’à 5’ exonucléasique. Elle est utilisée dans le séquençage de l’ADN. IV.2.3. LA Taq POLYMÉRASE. La Taq polymérase est une ADN polymérase extraite de bactéries présentes dans les sources chaudes. Elle permet de travailler à des températures plus élevées que les températures usuelles (ambiante ou 37°C). Elle est très utilisée dans les réactions d’amplification génique et également dans les réactions de séquençage de l’ADN. En principe, elle est dépourvue de l’activité exonucléasique 3’à 5’.

IV.3. LES ENZYMES RECOPIANT UN ARN EN UN ADN. IV.3.1. LA RÉTROTRANSCRIPTASE OU TRANSCRIPTASE INVERSE. Cette enzyme est surtout présente dans les rétrovirus (virus à ARN). Elle permet de fabriquer à partir d’un ARN messager (mARN) un cADN (ou séquence d’ADN complémentaire d’un mARN). Elle possède les propriétés suivantes: - C’est une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à3’. - Elle est ARN-dépendante - Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à 5’, donc de fonction d’édition. Elle peut donc insérer des bases par erreur. - Elle a une activité RNAse.

IV.4. LES ENZYMES RECOPIANT UN ADN EN UN ARN. Les ARN polymérases réalisent des transcriptions de l’un des deux brins d’ADN en un brin d’ARN. Elles sont extraites des bactéries.  Ces ARN polymérases possèdent les propriétés suivantes:   - Elles synthétisent le brin nouveau dans le sens 5’à 3’.   - Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse (à la différence des ADN polymérases).   - Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou NTPs) et également (comme les autres polymérases) des ions Mg2+.   - Elles sont dénuées d’activité d’édition.  Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN polymérases ne peuvent démarrer la transcription que si l’ADN à transcrire possède le promoteur spécifique correspondant.

Chapitre 5 LES TECHNIQUES DE BASE DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE I. PURIFICATION DES ACIDES NUCLÉIQUES. I.1. Extraction à partir de matériels biologiques. I.2. Estimation des quantités d’ADN. II. MIGRATION ÉLECTROPHORÉTIQUE DES FRAGMENTS D’ADN. III. LE TRANSFERT SELON SOUTHERN. III.1. Principe. III.2. Réalisation pratique. III.3. Utilisations de la technique de Southern. IV. LA TECHNIQUE D’AMPLIFICATION GÉNIQUE OU TECHNIQUE PCR. IV.1. Principe. IV.2. Réalisation pratique. IV.3. Utilisations des produits PCR.

I. PURIFICATION DES ACIDES NUCLÉIQUES. I.1. EXTRACTION A PARTIR DE MATÉRIELS BIOLOGIQUES. Les acides nucléiques sont souvent extraits du sang total. -   Le procédé classique est l’extraction par le couple phénol-chloroforme. Le phénol est un excellent agent dénaturant des protéines et il permet de séparer efficacement les protéines et les acides nucléiques. -    Il est ensuite éliminé par l’extraction avec du chloroforme (non miscible avec l’eau). La séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par centrifugation.   -  La phase aqueuse contient les acides nucléiques. Des traitements par des agents clivant les protéines (protéolyse) peuvent être nécessaires. Les acides nucléiques peuvent être finalement récupérés sous forme solide à la suite de précipitation par l’alcool éthylique ou par l’alcool isopropylique.

I.2. ESTIMATION DES QUANTITÉS D’ADN.   Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un matériel biologique. Elle s’effectue par spectrophotométrie dans l’ultra-violet à 260 nm. Il est indispensable de mesurer également l’absorption à 280 nm. Cette dernière longueur d’onde permet d’estimer la contamination éventuelle de l’extrait par des protéines. L’absorption se définit par l’unité de densité optique mesurée à 260 nm. Une unité de densité optique correspond à l’absorption d’une solution d’ADN double brin à la concentration de 50 µg/ml ou à l’absorption d’une solution d’ADN simple brin (ou d’ARN) à la concentration de 25 µg/ml.

II. MIGRATION ÉLECTROPHORÉTIQUE DES FRAGMENTS D’ADN.  Les fragments d’ADN après digestion par les enzymes de restriction peuvent être séparés par électrophorèse sur un gel d’agarose. -     Dans ce type de gel, les migrations des fragments d’ADN dépendent de la taille du fragment plus que de la charge de celui-ci. Plus le fragment a une taille élevée, moins la migration électrophorétique par rapport au puits d’inclusion sera importante. A l’opposé les fragments de petite taille auront une distance de migration la plus élevée. -      La détermination précise des tailles des fragments séparés par électrophorèse est effectuée en faisant migrer des marqueurs de poids moléculaire en parallèle avec les échantillons à analyser     

- La détection de l’ADN : se fait par exposition aux rayons UV avec du bromure d’éthidium (agent s’intercalant entre les brins d’ADN). - L’électrophorèse des fragments d’ADN en gel d’agarose permet des séparations jusqu’à 20-25 kb (20000-25000 pb). - Des fragments d’ADN de taille restreinte (inférieure à 1000 paires de bases) peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

III. LE TRANSFERT SELON SOUTHERN. III. 1. PRINCIPE. Cette méthode a été initialement décrite par E.M. SOUTHERN en 1975. Elle consiste à détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope. 

III. 2. RÉALISATION PRATIQUE. Les étapes sont les suivantes:   III. 2.1. Extraction de l’ADN génomique. Cette extraction s’effectue à partir des leucocytes circulants par exemple obtenus à partir de sang total. III. 2.2. Digestion par des enzymes de restriction différentes du même ADN génomique. L’ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes: dans le tube 1, on réalisera une digestion par l’enzyme 1; dans le tube 2, une digestion par l’enzyme 2; etc....). On peut réaliser des digestions par deux enzymes dans un même tube.

III. 2. 3. Séparation électrophorétique des fragments d’ADN par électrophorèse sur un gel d’agarose.   Après séparation électrophorétique en gel d’agarose des fragments d’ADN bicaténaires obtenus par digestion enzymatique, on réalise une dénaturation des fragments par un traitement alcalin du gel d’électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments d’ADN double brin (ou bicaténaires) en fragments d’ADN monobrin (ou monocaténaires). III. 2. 4. Transfert des fragments monocaténaires du gel d’agarose à un support souple (feuille de nylon par exemple).  Le transfert des fragments monocaténataires du gel d’agarose à un support type nylon s’effectue par simple capillarité.

III. 2. 5. Fixation des fragments monocaténaires d’ADN sur le support souple et hybridation dans des conditions optimales avec une sonde complémentaire marquée à un radioisotope.

III.3. UTILISATIONS DE LA TECHNIQUE DE SOUTHERN. III.3.1. Carte de restriction de l’ADN.   Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de séquences parfaitement définies. Il est donc possible d’établir une véritable carte d’un gène donné par la technique de SOUTHERN. Cette carte porte le nom de carte de restriction. En pratique, l’ADN à étudier est réparti en différentes fractions. Chaque fraction est traitée par une enzyme de restriction ou un couple d’enzymes de restriction. Ainsi dans l’exemple ci-dessous. Dans le puits 1, on dépose l’ADN digéré par Eco RI seule; dans le puits 2, on dépose l’ADN digéré par Hind III seule et dans le puits 3, l’ADN digéré par Eco RI et Hind III. La détection des différents fragments est réalisée à l’aide d’une sonde marquée du gène étudié

(1): Position des coupures par Eco RI. (2): Position des coupures par Hind III. (3): Position des coupures par Hind III + Eco RI.

IV. LA TECHNIQUE D’AMPLIFICATION GÉNIQUE OU TECHNIQUE PCR® (« POLYMERASE CHAIN REACTION »).  IV. 1. PRINCIPE.  Cette technique décrite en 1985 (K. MULLIS et collaborateurs) permet d’amplifier des séquences d’ADN de manière spécifique et d’augmenter de manière considérable la quantité d’ADN dont on dispose initialement. Elle nécessite de connaître la séquence des régions qui délimitent l’ADN à amplifier. Ces séquences serviront à synthétiser des amorces oligonucléotidiques complémentaires (de longueur de 20 à 30 nucléotides en général). Ces oligonucléotides serviront à délimiter la portion d’ADN à amplifier. L’ADN polymérase les utilisera comme amorces.

IV. 2. RÉALISATION PRATIQUE.   La technique comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession de trois phases: -  Une phase de dénaturation par la chaleur pour séparer les deux brins d’ADN (92-95°C)(30 secondes-1 minute). - Une phase d’hybridation avec les deux amorces spécifiques entre 55-60°C. La première amorce se fixe sur un brin d’ADN, l’autre sur le brin complémentaire (30 secondes-1 minute). - Une phase d’extension par l’ADN polymérase à partir des amorces à 70-72°C (1-2 minutes).

Cette technique a pris un essor considérable avec l’introduction d’une ADN polymérase résistante à la chaleur. Cette ADN polymérase ou Taq polymérase est extraite d’une bactérie thermophile (Thermus aquaticus). Elle permet une automatisation des différents cycles (dans des appareils appelés thermocycleurs). Le nombre de cycles est généralement compris entre 30 et 40. Cette méthode permet d’amplifier l’ADN compris entre les deux amorces d’un facteur de 105 à 106.

La Taq polymérase extraite de Thermus aquaticus présente une activité exonucléasique 5’à3’, mais elle est dénuée d’activité exonucléasique 3’à5’, c’est-à-dire de la fonction d’édition. Elle peut insérer des bases qui ne suivent pas la règle classique d’appariement et ceci au hasard. On estime qu’elle réalise une mauvaise incorporation toutes les 104 à 105 bases.

Chapitre 6 LA RÉPLICATION DE L’ADN I. GÉNÉRALITES.   Lors de la division cellulaire: La cellule-mère donne deux cellules-filles, l’ADN présent dans les cellules-filles est une copie identique de l’ADN présent dans la cellule-mère. C'est la réplication de l’ADN.

II. LA RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES PROCARYOTES.   II.1. Les caractéristiques générales. -La réplication est tout d’abord dite semi-conservatrice (Meselson et Stahl, 1958). Ceci signifie que sur les deux brins d’ADN, on a toujours un brin d’ADN qui provient d’un des deux brins de l’ADN parental et un brin nouvellement formé. - A chaque réplication, les deux brins d’ADN parental se séparent, chacun de ces deux brins sert de matrice pour la synthèse d’un brin complémentaire.

La réplication de l’ADN nécessite:   - Une matrice d’ADN constituée par un brin parental. -  La présence de dATP, dTTP, dCTP et dGTP   -  La présence de nombreux enzymes. - La présence de certains ions (cations bivalents: Mg2+)

II.2. Les mécanismes de l’initiation de la réplication. II.2.1. Notion de réplicon. L’unité d’ADN où se produit la réplication est appelée le réplicon. Ce réplicon a une origine où est initiée la réplication et une terminaison où est arrêtée la réplication.   -    L’ADN bactérien constitue à lui seul un réplicon. A partir d’un point d’initiation, la réplication peut progresser soit de manière unidirectionnelle, soit de manière bidirectionnelle.   Chez les procaryotes, à partir d’une origine de la réplication (ou oeil de réplication), la réplication progresse dans les deux sens (un oeil qui s’agrandit jusqu’à que la réplication s’achève).

II.2.2. Initiation de la réplication. Chez E. coli, il existe au niveau de l’ADN bicaténaire une origine unique de la réplication appelée OriC. Le locus OriC est constitué d’une séquence de 245 paires de bases.

II.3. La discontinuité de la réplication entre les deux brins d’ADN. La réplication n’est pas identique entre les deux brins d’ADN. En effet, sur l’un des brins la réplication s’effectue de manière continue, on parle de brin avancé, alors que sur l’autre brin elle s’effectue de manière discontinue, on parle de brin retardé.   Sur le brin avancé, la progression de la réplication se fait dans le sens 5’à3’ en utilisant comme modèle le brin d’ADN orienté dans le sens 5’à3’. Sur le brin retardé, des petits fragments d’ADN sont synthétisés, encore appelés fragments d’OKAZAKI. Chaque fragment est synthétisé dans le sens 5’à3’, le brin modèle correspondant de l’ADN est orienté de manière anti-parallèle 3’à5’.

III. LA RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES EUCARYOTES. III.1. Les caractéristiques générales.  La réplication de l’ADN chez les eucaryotes est tout à fait comparable à la réplication de l’ADN chez les procaryotes. Elle est généralement bidirectionnelle, elle est discontinue entre les deux brins d’ADN. Des amorces d’ARN sont nécessaires. Cette réplication est également complémentaire, antiparallèle et dans le sens 5’à3’.

  Réplication de l'ADN : (a) brins« parents » ; (b) brin continu (dit avancé), dans le sens 5' vers 3' ; (c) brin discontinu (dit retardé), formé de fragments d'Okazaki ; (d) lieu de séparation des brins par l’enzyme  hélicase ; (e) amorce ; (f) fragment d'Okazaki.

III. 2 Caractéristiques particulières. La réplication se fait en de nombreux points d’initiation.  Elle fait intervenir un nombre d’ADN polymérases plus important que chez les procaryotes. (5 ADN polymérases chez les eucaryotes).  n      La polymérase alpha/primase. Cette polymérase est impliqué dans l'initiation de la réplication ("priming"). n          La polymérase béta. n          La polymérase gamma. n          La polymérase delta. n          La polymérase epsilon.

Chapitre 12. LES VECTEURS ET LES SONDES NUCLÉIQUES I. QUELQUES RAPPELS DE DÉFINITIONS DE TERMINOLOGIES UTILISÉES EN BIOLOGIE MOLÉCULAIRE I.1. NOTION D’ADN RECOMBINANT. Il s’agit d’un ADN hybride obtenu au laboratoire par la combinaison de deux ADN appartenant à deux espèces différentes. I.2. NOTION DE VECTEURS. On appelle vecteur l’ADN dans lequel on insère le fragment d’ADN à étudier. L’ADN inséré est appelé insert ou ADN étranger ou ADN exogène. Cette séquence nucléotidique est capable de s’auto-répliquer.

I.3. NOTION DE CLONE. Le clone correspond à un grand nombre de molécules ou de cellules identiques provenant d’un seul ancêtre (cellule ou molécule). L’opération qui consiste à obtenir ce grand nombre de cellules ou de molécules s’appelle le clonage. I.4. LES BANQUES D’ADN COMPLÉMENTAIRE (cADN). Les ADN complémentaires (ou cADN) proviennent des mARN et donc ne possèdent pas d’introns. A partir d’un même type de cellules, on prépare les mARN totaux de ces cellules puis les cADN correspondants. Ces derniers insérés dans des vecteurs constituent une banque de cADN.

I.5. LES BANQUES D’ADN GENOMIQUE. Le clivage de l’ADN génomique par des enzymes de restriction génèrent de nombreux fragments. L’insertion de ces fragments dans des vecteurs permet de constituer une banque d’ADN génomique. Cette banque contient plus d’information que la banque d’ADNc. En effet, elle contient potentiellement toutes les séquences géniques (introns et exons). Il faut rechercher dans les nombreux vecteurs après insertion des fragments, les vecteurs possédant le fragment d’ADN recherché. Cette opération s’appelle le criblage.

II. LES VECTEURS II.1. GÉNÉRALITES. Les vecteurs sont des petits ADN dans lesquels on insère un fragment d’ADN que l’on veut étudier. Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages. Il est nécessaire d’introduire ces bactériophages ou plasmides dans les bactéries pour réaliser une multiplication de ceux-ci. II.2. LES PLASMIDES. Les plasmides sont des petits fragments d’ADN circulaire présents dans la cellule bactérienne et indépendants du génome bactérien.

II.2.1. PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES. Les plasmides présentent les caractéristiques suivantes: - Leur ADN est bicaténaire, circulaire avec un nombre de nucléotides inférieur à 10 kb (1 kilobase = kb = 1000 nucléotides). - Le nombre de plasmides dans une cellule bactérienne peut être considérable (plusieurs centaines). - Les plasmides portent normalement des gènes qui leur confèrent un avantage sélectif, par exemple une résistance à un antibiotique. - Leur réplication est indépendante de celle du génome bactérien.

II.2.2. PRÉPARATION DES PLASMIDES. Les bactéries contenant les plasmides sont mises en culture dans un grand volume (jusqu’à 2 litres de milieu de culture). Quand la concentration bactérienne atteint une valeur suffisante, on traite par un antibiotique (comme le chloramphénicol) qui empêche la croissance bactérienne sans affecter la réplication des plasmides. On récupère les bactéries par centrifugation. Puis, on perméabilise la paroi bactérienne par un traitement doux permettant d’obtenir un passage en solution des plasmides qui sont plus légers que l’ADN bactérien. La purification des plasmides peut être ensuite réalisée par chromatographie liquide à haute performance ou ultra-centrifugation en gradient de densité.

II.2.3. Préparation des plasmides pour la recombinaison, constitution de l’hybride et transformation bactérienne. L’insertion d’une séquence d’ADN bicaténaire dans un plasmide nécessite un traitement préalable par une enzyme de restriction. On choisit une enzyme qui a un site unique dans la séquence plasmidique. Après action de l’enzyme de restiction, le plasmide circulaire est linéarisé. Pour maintenir la linéarisation, il est indispensable de traiter le plasmide linéaire par une phosphatase alcaline qui enlève les groupements phosphates en 5’. Le plasmide linéarisé et traité par une phosphatase alcaline est ajouté au fragment d’ADN à insérer en présence d’une ligase. L’ensemble de ces étapes produit un plasmide recombinant.

II.2.4. AVANTAGES ET DÉSAVANTAGES DES PLASMIDES. II.2.4.1. Avantages: - Petite taille du vecteur, permettant un travail expérimental aisé. - Sélection des plasmides recombinants (sélection par les antibiotiques). II.2.4.2. Désavantages: - Impossibilité d’insérer des larges fragments d’ADN.

Le plasmide pBR 322 (Bolivar et Rodriguez) est le plus utilisé

II.3. LES PHAGES. II.3.1. PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES. Les phages sont des virus qui infectent les bactéries. Deux phages sont très utilisés comme vecteurs: le phage lambda et le phage M13. Les séquences de ces phages utilisés comme vecteurs sont connues (40 à 50 kb d’ADN double brin). Les extrémités de cet ADN sont simples brins sur une longueur réduite (12 nucléotides), et complémentaires l’une de l’autre et surtout formant des extrémités cohésives. Ces séquences sont appelées séquences cos (pour cohésives).

Deux parties sont individualisées dans le phage lambda: - La tête du virus: elle renferme l’ADN viral. - La queue du virus: elle renferme des protéines. Elle permet la fixation du virus sur la cellule-hôte bactérienne. Le virus lambda se multiplie selon deux modes possibles: soit par multiplication lytique, soit par multiplication lysogénique.

- La multiplication lytique. Le virus s’adsorbe spécifiquement à la surface des bactéries. Il injecte son ADN à la cellule-hôte. L’ADN viral se circularise dans la bactérie. Puis, une phase complexe de réplication débute et aboutit à la constitution de nombreuses particules virales à l’intérieur du cytoplasme bactérien. La lyse bactérienne provoque la libération des particules virales. - La multiplication lysogénique. Comme dans la multiplication lytique, le virus s’adsorbe et pénètre dans la bactérie. L’ADN viral s’intègre à l’ADN bactérien et sera répliqué en même temps que lui.

Le génome du phage lambda peut être divisé en: - Parties essentielles comprenant: * les gènes codant pour les protéines situées dans la tête et les protéines situées dans la queue du virus. * Les sites cos. Le site de réplication de l’ADN viral. Parties non essentielles: Ce sont les gènes impliqués dans la lysogénie.

II.3.2. AVANTAGES ET DÉSAVANTAGES DES PHAGES. La taille des fragments d’ADN insérables est supérieure à celle des plasmides (20-25 kb). La transformation des bactéries (=incorporation des phages) est plus efficace que pour les plasmides. Désavantages: Nombre de sites de restriction restreints dans le génome des phages. Obligation d’empaqueter l’ADN.

II.4. LES COSMIDES. II.4.1. PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES. Les cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides: phage lambda-plasmides. En fait, ils se comportent comme des plasmides avec des sites de restriction permettant l’insertion d’ADN étranger. Ils renferment également un gène de résistance aux antibiotiques (ampicilline). De plus, un site cos d’un virus lambda a été inclus dans leur ADN circulaire ce qui permettra au cosmide d’être empaqueté dans la tête d’un virus lambda.

II.4.2. AVANTAGES ET DÉSAVANTAGES DES COSMIDES. La taille des fragments insérables peut atteindre 50 kb. Leur incorporation dans les bactéries (transformation) est plus efficace que pour les plasmides. Désavantages: Obligation d’empaqueter l’ADN.

III. LES SONDES NUCLÉOTIDIQUES III.1. DÉFINITION. Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui permet de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique que l’on désire étudier. Cette réaction sonde-fragment correspond à une réaction d’hybridation moléculaire.

III.2. CARACTÉRISTIQUES GÉNÉRALES. Une sonde nucléotidique peut être soit une séquence d’ADN ou d’ARN, mais obligatoirement monobrin. Sa taille est très variable: 20-30 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides. La sonde est complémentaire et antiparallèle du fragment recherché. La sonde doit être facilement repérable grâce à un marquage avec un radioisotope (marquage chaud), mais il existe également des sondes appelées sondes froides sans marquage par un radioisotope.

III.3. OBTENTION D’UNE SONDE. Une sonde oligonucléotidique peut être fabriquée par synthèse chimique, si la séquence de l’ADN à repérer est connue. Si elle est inconnue, on peut étudier la protéine correspondante et remonter grâce au code génétique à la séquence d’ADN. Une sonde peut être un cADN.

Localisation d'un gène - De nombreuses techniques en biologie moléculaire sont employées pour déterminer où se trouve un gène spécifique dans le génome humain. Cette tâche est loin d'être facile, puisque le génome humain contient des milliers de gènes, dont bon nombre n'ont pas encore été découverts ou séquencés. Les sondes d'ADN sont bien utiles à cette fin.

- Isolement d'un gène - Si nous voulions introduire un gène humain dans une autre cellule, il ne nous suffirait pas de savoir où se trouve ce gène dans le génome humain. Nous devrions également isoler une copie du gène, de façon à pouvoir l'insérer dans la nouvelle cellule. Par exemple, le gène de l'insuline humaine doit être isolé des cellules humaines de sorte à pouvoir être introduit dans les cellules de la bactérie E. coli. Par suite de l'incorporation du gène, les cellules bactériennes produisent la protéine de l'insuline humaine que l'on peut administrer aux diabétiques.

Pour isoler un gène, on peut travailler à rebours à partir de son produit protéique. Tout d'abord, au moins une partie de la protéine est séquencée, ce qui signifie que l'ordre des acides aminés qui constituent la chaîne protéique est déterminé. En général, il suffit de connaître les 30 premiers acides aminés de la protéine.

Ensuite, on construit une sonde d'ADN monocaténaire complémentaire de la séquence prévue d'ARN messager. Par exemple, si une partie de la séquence prévue d'ARN messager est CUA GUA CGA, la section correspondante de la sonde d'ADN serait GAT CAT GCT,

La sonde d'ADN monocaténaire est ensuite incubée avec un échantillon censé contenir la matrice complète de la protéine d'ARN messager. Lorsque nous isolerons l'ARN messager auquel se lie la sonde d'ADN, nous aurons probablement trouvé l'ARN messager que nous cherchions.

Une fois que l'on a trouvé le brin d'ARN messager, il suffit de travailler à rebours nous devons synthétiser le brin d'ADN qui aurait servi de matrice pour l'ARN messager. Il nous faut synthétiser de l'ADN à partir d'ARN

Chapitre 12 Banques d’ADN

I. Clonage d’ADN Pour effectuer des analyses dans n’importe quel domaine, il nous faut une quantité importante de la matière à analyser. Puisque les séquences d’ADN existent en faible quantité, les analyses détaillées des séquences spécifiques d’ADN sont difficiles et parfois impossibles. Donc, la meilleure technique qui a permis aux séquences spécifiques d’ADN d’être isolées à partir des mélanges complexe et copiées, permettant ainsi des analyses plus détaillées, est le clonage d’ADN.

Pour réaliser le clonage, l’ADN est recombiné avec l’ADN vecteur et introduit dans les cellules hôtes où il sera copié. Le vecteur recombiné est purifié à partir des cultures des cellules hôtes et l’ADN cloné peut être adressé aux analyses.

II. Banques d’ADN Banques génomiques Banques d’ADN complémentaire

Généralement il existe deux types de banques : Banques formées à partir d’ADN génomique sont appelées banques génomiques. Banques formées à partir d’ADN complémentaire (ADNc) sont connues sous le nom de banques d’ADNc.

Les clones utilisés pour construire des banques génomiques sont des copies de l’ADN de chromosomes, alors que ceux d’ADNc sont des copies totales ou partielles de l’ARN messager. Les vecteurs les plus utilisés dans la construction des deux banques sont les plasmides et le phage .

II.1 Banques génomiques Une telle banque est formée d’une collection de molécules recombinées contenant toutes les séquences d’ADN d’une espèce donnée. Cette molécule recombinée correspond à un assemblage de l’ADN étudié avec l’ADN du vecteur (plasmides pour les petits génomes ou phage  pour les grands génomes). Cet ADN recombiné est introduit par la suite dans une cellule hôte (bactérie E.coli). une fois cette banque préparée, le vecteur contenant une séquence d’ADN choisie peut être sélectionnée par hybridation avec une sonde appropriée.

Dimension d’une banque La dimension de cette banque dépend de la quantité de l’ADN présente dans une cellule de l’organisme étudié. Par exemple, le génome humain est de 3.2 milliards de paires de bases; si pour son insertion dans le vecteur, cet ADN doit être coupé en fragments d’environ 20 Kb, il faudra alors 106 vecteurs recombinés (dans ce cas se sont les bactériophages qui sont utilisés comme vecteurs).

 Le nombre minimum de recombinants nécessaires, pour qu’une séquence quelconque soit présente dans la banque, peut se calculer par la formule proposée par Clarke et Carbon en 1976: ln (1-P) N= ln (1-F) N: Nombre nécessaire de recombinants dans la banque (avant amplification) P: probabilité d’avoir des recombinants F: taille d’ADN inséré/taille d’ADN génomique

Etapes de contruction d’une banque génomique - Extraction d’ADN total - Purification d’ADN extrait - Digestion partielle de l’ADN - Insertion dans le vecteur - Ligature - Empaquetage - introduction dans la cellule hôte et culture bactérienne.

Hybridation moléculaire

II.2 Banques d’ADN complémentaire (ADNc) Les étapes suivantes sont exigées pour construire une banque d’ADNc: -Isolement et purification de l’ARNm. -Synthèse de l’ADNc. -Insertion de l’ADNc dans le vecteur. -Introduction des vecteurs recombinés dans la cellule hôte.

Sous-clonage Pour avoir des détailles plus précises de gène qu’on veut étudier, une technique très efficace est utilisé, appelée sous-clonage,qui consiste à transférer le fragment d’ADN déjà cloné d’un vecteur à un autre. Dans le cas de plasmide (comme vecteur) dans E.coli, les étapes suivantes sont exigées.

Isolement d’ADN du plasmide contenant la séquence clonée. Digestion du plasmide par le biais de l’enzyme de restriction. Séparation des fragments par électrophorèse sur gel d’agarose. Purification du fragment désiré. Insertion du fragment dans un nouveau vecteur (plasmide) pour former une nouvelle molécule recombinée. Introduction du plasmide recombiné dans E. coli. Sélection des bactéries transformées. Analyse des plasmides recombinés.