Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN.

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1 Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN

2 ADN Genomique Extra-genomique Prokaryote vs. eukaryote
Circulaire ou linéaire Un ou plus d’un chromosomes Extra-genomique Vecteurs Plasmides

3 Vecteurs Vs Plasmides Vecteur:
Véhicule d’ADN permettant le clonage, le maintien et l’amplification d’une séquence d’ADN Plasmides Virus Chromosomes Tous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides

4 Plasmides Petites molécules d’ADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Amplification chez les bactéries Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou l’expression d’ADN d’intérêt

5 Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques
Sites de restrictions uniques pour le clonage Origine de réplication (Ori) Marqueur de sélection Gènes de résistance aux antibiotiques

6 Isolation d’ADN Buts Isolation de l’ADN désiré
Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantes ADN chromosomique ou plasmidique? Protéines ARN Produits chimiques Sels, détergents, etc.

7 Isolation d’ADN (suite)
Lyse cellulaire Paroi et membrane Enzymatique Chimique Mécanique Isolation de l’ADN désiré Sédimentation différentielle Chromatographie Retirer les autres composantes

8 Isolation d’ADN Plasmidique par Lyse Alcaline (E.coli )

9 Solutions utilisées Sol. I – Tampon de suspension
Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyse NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN SDS - dissous membranes, denture et lie protéines

10 Solutions utilisées (suite)
Sol. III- Acétate de potassium Renaturation de l’ADN Précipite SDS Précipite ADN génomique et protéines Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Sels demeurent solubles TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??

11 Quantification de l’ADN
Déterminer la Conc. d’ADN A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL Déterminer la quantité d’ADN 1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg ADN 1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng ADN Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION

12 Électrophorèse sur gel d’agarose
Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins d’après la taille et la conformation Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp Pouvoir de résolution entre fragments ≥100pb

13 Plasmide non digéré sur gel
- Plasmide non digéré sur gel - Les plasmide non digérés génèrent un patron de bandes La migration est une fonction de la taille et de la conformation Super enroulé Relâché Multimèrs? multimèrs relâché Super enroulé +

14 Migration d’ADN linéaire-plasmide digéré
La vitesse de migration est une fonction de la taille Les plus petits fragments migrent plus rapidement La vitesse de la migration est inversement proportionnelle au log10 de la taille

15 Migration d’ADN linéaire-plasmide digéré
1000 bp 850 bp 750 bp 600 bp 200 bp 100 bp +

16 Déterminer les tailles des fragments
Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 1 Générer une courbe étalon è partir de l’echelle de tailles moléculaires Déterminer la distance de migration qui correspond èa chaque taille Taille (pb) Distance (mm) Etc

17 Déterminer les tailles des fragments
Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 2 Entrer les données dans Excel Covertir les tailles en log

18 Déterminer les tailles des fragments
Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 3 Générer la courbe dans Excel

19 Déterminer les tailles des fragments
Fingerprinting Standard Curve: Semi-log Étape 4 Déterminer les tailles inconnues d’après les distances de migrations 3.55 Prendre l’inverse du log pour obtenir la taille = 3548 bp

20 Visualisation: Bromure d’éthidium
Colorant utilisé pour rendre les acides nucléiques visibles Fluorescents sous les UV Liaison proportionnelle à La taille La quantité La conformation

21 Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel d’agarose?
Est-ce qu’il y a de l’ADN Combiens de conformations Combien de fragments Taille des fragments Taille totale des molécules d’acides nucléiques Nombre de coupures Linéaire? Circulaire?