Les méthodes de phasage PARTIE II Les méthodes de phasage

INTRODUCTION ET RECAPITULTIFS

Introduction 1.Les principales étapes Question biologique Clonage, expression, purification Cristaux Données de diffraction Interprétation biologique Collecte et intégration des données Phasage des réflexions Affinement cristallographique Cristallisation Question biologique Analyse bioinformatique Macromolécules de grande pureté Structure atomique = MODELE Carte de densité électronique 1.Les principales étapes

Impact du rayon diffracté sur le détecteur 2D Introduction 2. Relations cristal - l’image de diffraction - structure ? cristal ? Impact du rayon diffracté sur le détecteur 2D Image de diffraction structure

1. Principe du phasage 2. Relations cristal - l’image de diffraction - structure Le cristal « fait » une analyse de Fourier en produisant les données de diffraction Intensité des faisceaux diffractés = RR pondéré xyz Fhkl xyz Fhkl Le cristallographe doit faire une synthèse de Fourier pour reconstruire la densité électronique Valeur de la densité électronique en chaque point de la maille

Introduction 2. Relations cristal - l’image de diffraction - structure z Transformation de Fourier r diffraction h y x k h Espace réel Espace réciproque réseau 3D cristal taches de diffraction réseau direct réseau réciproque Densité électronique ρ(x,y,z) F(h,k,l) Facteurs de Structure diffraction Transformation de Fourier

1. PRINCIPE DU PHASAGE

1. Principe du phasage 1.1. Densité électronique et facteur de structure On a vu que le facteur de structure s’exprime en fonction de la densité électronique : Inversement, on peut montrer que la densité électronique s’exprime en fonction des facteurs de structure par une relation analogue : avec F(h,k,l) défini par une amplitude ET une phase C’est la synthèse de Fourier de la densité électronique

1. Principe du phasage 1.1. Densité électronique et facteur de structure Plusieurs écritures fj Sommation sur les atomes Sommation sur les électrons TF inverse

1. Principe du phasage 1.2. Transformation de Fourier Pas de relation simple entre (xyz) et (hkl)

1. Principe du phasage 1.2. Transformation de Fourier fj (ou xyz) x,y,z | Fhkl | hkl Fhkl = nombre complexe Fhkl (|Fhkl|,hkl) h,k,l xyz xyz = nombre réel TF TF-1

1. Principe du phasage Fhkl = A + iB = |F|ei 1.3. Le facteur de structure Pour chaque réflexion (hkl) : défini par une amplitude : Fhkl = A + iB = |F|ei Ahkl = ∑ fj cos(2π(hxj+klj+lzj)) Bhkl = ∑ fj sin(2π(hxj+klj+lzj)) et une phase :

|F(hkl)| = |F(-h-k-l)| 1. Principe du phasage 1.3. Le facteur de structure Pour chaque réflexion (hkl) : LOI de FRIEDEL |F(hkl)| = |F(-h-k-l)| φ(hkl) = -φ(-h-k-l)

1. Principe du phasage 1.4. Principe des méthodes de phasage La connaissance de Fhkl en module et en phase est une condition indispensable au calcul de ρ(xyz), donc à la résolution de la structure L’expérience conduit au module du facteur de structure (intensité des taches du cliché de diffraction) mais ne conduit pas à la phase L’objectif des méthodes de résolution est de déterminer les phases des facteurs de structures

= liste des réflexions (h,k,l) 1. Principe du phasage 1.4. Principe des méthodes de phasage (x,y,z) = TF-1 (F(h,k,l)) Fobs avec Fhkl = Fhkl eihkl I1/2 Données de diffraction traitées = liste des réflexions (h,k,l) 1 1 0 157984.0 1667.2 2 1 0 32571.8 836.2 3 1 0 28649.7 855.3 4 1 0 21480.3 767.4 5 1 0 8201.6 590.4 6 1 0 272377.2 3366.9 ……… Facteurs de Structure (module, phase) ? Méthodes indirectes = estimation Données de diffraction brutes truncate xdsconv

1. Principe du phasage 1.4. Principe des méthodes de phasage Les méthodes reposent sur une propriété remarquable de la série de Fourier : sa convergence Connaissant approximativement un certain nombre de phases, une première synthèse de Fourier fait apparaître des atomes de la structure On peut ainsi déduire de nouvelles phases et améliorer les phases de départ, une deuxième synthèse de Fourier fait apparaître d’autres atomes On recommence le cycle

1. Principe du phasage 1.5. L’importance des phases 0 ° = rouge http://www.yorvic.york.ac.uk/~cowtan/fourier/fourier.html 0 ° = rouge 120 ° = vert 240 ° = bleu Dr Kevin Cowtan York Structural Biology Laboratory, Department Of Chemistry University of York Module = intensité Phase = couleur

1. Principe du phasage 1.5. L’importance des phases TF TF Modules du canard et phases du chat intensité canard couleur chat Modules du chat et phases du canard TF-1 TF-1

1. Principe du phasage 1.5. L’importance des phases 2 objets sont similaires TF TF-1 Les TF sont similaires Dans le cas de cristaux : il faut que les cristaux soient isomorphes (mêmes paramètres de maille, même groupe d’espace, même orientation dans l’ua) TF TF-1 Ce principe de base est utilisé : - dans le phasage par remplacement moléculaire - dans l’étape d’affinement

1. Principe du phasage 1.5. L’importance des phases cristal TF Expérience de diffraction On ne dispose que des modules du facteurs de structure Modules seuls monochrome modèle Modèle similaire à la structure TF calc Par calcul, on dispose du module ET de la phase Modules + phases cf Remplacement moléculaire

1. Principe du phasage 1.5. L’importance des phases Lorsque 2 structures sont similaires, on peut combiner les modules TF-1 Modules du chat et phases du Manx TF-1 2 x M(chat) - M(manx) et phases du Manx cf Calcul des cartes de densité

1. Principe du phasage 1.6. Les différentes méthodes Méthodes directes Remplacement isomorphe STRUCTURE Remplacement moléculaire Diffusion anomale

1. Principe du phasage 1.6. Les différentes méthodes Méthodes 1. Les méthodes directes - petites molécules - en phase de développement pour les macromolécules Méthodes directes 2. Le remplacement isomorphe - cristal natif et cristaux de dérivés lourds - SIR, MIR, SIRAS Remplacement isomorphe STRUCTURE 3. La diffusion anomale - cristal avec diffuseurs anomaux - SAD, MAD 4. Le remplacement moléculaire - nécessité d’une structure homologue disponible (PDB) Remplacement moléculaire Diffusion anomale

De plus en plus utilisée 1. Principe du phasage 1.7. Choix de la méthode à utiliser Recherche d’homologues dans les banques protéiques OUI Remplacement Moléculaire succès de la méthode dépend du taux de ressemblance de la structure étudiée par rapport à la structure de la PDB NON Remplacement isomorphe Diffusion anomale Combinaison des 2 méthodes De plus en plus utilisée

1. Principe du phasage 1.8. Remarque sur les méthodes directes Autre nom : méthodes ab initio Méthode encore peu utilisée mais en développement Applicable pour : Des structures d’environ 1000 atomes (max 2000) Résolution atomique (d < 1.2 Å) Quelques cas à 2.0 Å de résolution Les phases sont directement déterminées à partir des amplitudes observées grâce à des relations mathématiques existant entre les phases (à partir de valeur initiales, déduction d’autres valeurs) Ces relations existent si la densité électronique est : (1) partout positive (r)  0 positivité (2) composé d’atomes discrets atomicité

1. Principe du phasage 2 types d’applications 1.8. Remarque sur les méthodes directes 2 types d’applications Développement des méthodes directes pour les structures de macromolécules G. Bricogne « phasage ab initio » Methods in Enzymology, vol 277 (1997) Détermination de la « sous-structure » des atomes lourds ou des diffuseurs anomaux cf 2.4 et 3.5 

2. LA FONCTION DE PATTERSON

2. La fonction de Patterson 2.1. Définition P(uvw) = 1/v h  k  l | Fhkl |2 exp (-2i (hu + kv + lw)) Or | Fhkl |2 = | F-h-k-l |2 P(uvw) = 1/v h  k  l | Fhkl |2 cos (2 (hu + kv + lw)) La fonction de Patterson est une synthèse de Fourier - qui a pour coefficients = les intensités diffractées - qui a pour phases = 0 avec u,v,w = coordonnées relatives dans la maille du cristal La fonction de Patterson est la transformée de Fourier des intensités

2. La fonction de Patterson 2.1. Définition Autre écriture : P(u,v,w) = r (x,y,z) (x + u, y + v, z + w) dv La fonction P(u,v,w) a des valeurs significatives seulement si (u,v,w) est un vecteur interatomique Valeur moyenne, sur une période du produit des densités électroniques séparées par un vecteur (u,v,w) Une valeur élevée de P(u,v,w) est observée si, quelque part dans la maille, des maxima de densité sont séparés par un vecteur (u,v,w) Inversement, P(u,v,w) atteint un maximum dès que le vecteur (u,v,w) relie 2 maxima de la densité électronique

2. La fonction de Patterson 2.2. Exemple 2D à 3 atomes Soient 2 cartes identiques de densité électronique à 3 atomes A B C A B (r) = (x,y,z) (u) = (u,v,w) C P(u) = r (r) (r + u) dv A B C u = CB  P(u)  0 u = quelconque  P(u) = 0 A B C A B C A B C u = 0  P(u) est max A B C u = AC  P(u)  0 A B C u = AB  P(u)  0

2. La fonction de Patterson 2.2. Exemple 2D à 3 atomes Fonction (ou carte) de Patterson correspondante C  A B  A C  B L’intensité d’un pic est proportionnel au numéro atomique des atomes dont provient ce pic (ZiZj) 6 pics dans la maille

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson Nombre de pics uniques N(N-1)/2 Exemple 1000 atomes 499500 pics !! La fonction de Patterson est une fonction représentative de tous les vecteurs interatomiques existant dans la maille cristalline 2 types de vecteurs : - vecteurs entre 2 atomes différents - vecteurs entre 2 mêmes atomes reliés par symétrie La fonction de Patterson d’une protéine est inutilisable

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson En pratique : 3 applications (1) Patterson native On observe un pic dès que 2 molécules sont reliées par translation (2) Patterson isomorphe F2PH – F2P = ΔFiso Localisation des positions des atomes lourds dans la maille (voir 4. Remplacement isomorphe) (3) Patterson anomale (F+ - F-)2 = ΔFano Localisation des positions des atomes anomaux dans la maille (voir 3. Diffusion anomale)

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (1) Patterson native directement calculée à partir des données de diffraction 2 molécules reliées par translation grand nombre de vecteurs tous identiques u Maille du cristal w 1  2 2 pics symétriques correspondant à la translation 2  1 Carte de Patterson

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (2) Patterson isomorphe et (3) Patterson anomale Voir partie (3) et partie (4) (4) Section de Harker Important pour les Patterson isomorphe et anomale Les éléments de symétrie de la maille cristalline peuvent engendrer des pics dans certains plans ou sections particulières Section de Harker Les coordonnées des vecteurs interatomiques entre 2 mêmes atomes reliés par la symétrie du cristal peuvent présenter des particularités

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker Exemple : groupe d’espace P21 (2 positions équivalentes) Matrice d’interaction : Déterminer les coordonnées des vecteurs interatomiques entre atomes reliés par symétrie (chaque atome existe en position 1 et 2) x y z -x y+1/2 -z 0 0 0 -2x +1/2 -2z 2x -1/2 2z Les vecteurs interatomiques entre positions symétriques présentent des coordonnées uvw particulières : ±2x ±1/2 ±2z

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker Les pics correspondants appartiennent tous à un plan v = 1/2 = SECTION DE HARKER maille w 2x 1/2 2z v -2x 1/2 -2z 2 pics u Carte des vecteurs interatomiques en v = +1/2 P(u,1/2,w) 1 atome

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker La section de Harker dépend du groupe d’espace - pas de symétrie : pas de section de Harker - axe de rotation selon b: section de Harker en v = 0 - axe de rotation selon c : section de Harker en w = 0 - axe hélicoïdal 21 selon b : section de Harker en v = 1/2 - axe hélicoïdal 31 selon c : section de Harker en w = 1/3 - axe hélicoïdal 41 selon c : section de Harker en w = 1/4 - etc …

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation TF de la molécule TF de la molécule molécule TF du cristal TF du cristal

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation En résumé Lorsque 2 molécules sont identiques (ou similaires) à une rotation près : Leurs Transformées de Fourier sont identiques à une rotation près (non accessibles !) Leurs fonctions de Patterson sont identiques à une rotation près, quelque soit la maille dans laquelle la molécule a été cristallisée Leurs clichés de diffraction sont différents

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation R(,,) = u P2(u) P1r(ur) du P(u) fonction de Patterson Pr(ur) fonction de Patterson après rotation La fonction R(,,) présente un maximum lorsque les 2 fonctions de Patterson se superposent ,, P1r superposition R(,,) est max P2

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation Les fonctions de Patterson P1(u) et P2(ur) sont calculées uniquement à partir des données (F2, pas de phase) On définit 2 types de fonction de rotation : (1) Fonction de self-rotation P1 et P2 calculées à partir du même cristal (2) Fonction de cross-rotation P1 calculée à partir du cristal 1 P2 calculée à partir du cristal 2

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation Applications de la fonction de rotation (1) Self-rotation Localisation des symétries de rotation dans le cristal - Direction des axes - cristallographiques - non cristallographiques - Pas d’informations translatoires (2) Cross-rotation Remplacement moléculaire : orientation du modèle

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation Définition de la localisation d’un axe de symétrie ω et Φ positionnent l’axe dans les 3 dimensions de l’espace Kappa (Κ) définit l’angle de rotation Représentation par des projections stéréographiques

2. La fonction de Patterson 2.4. La fonction de rotation Exemple Kappa = 180 ° Axe 2 Groupe d’espace P1 4 molécules dans l’unité asymétrique Axe 7 Kappa = 52 °

3. LA DIFFUSION ANOMALE

3. La diffusion anomale 3.1. Absorption des rayons X Le phénomène d’absorption Définition Diminution de l’intensité du rayonnement X lorsqu’une matière est traversée. Cette diminution suit une loi de décroissance exponentielle en fonction de la longueur traversée. I0 Exemples de l1/2 Air 4,1 m Aluminium 0,5 mm Plomb 4 µm I0/2 l l1//2 Applications Protection contre le rayonnement Ecrans absorbants de protection en plomb l = Longueur traversée

3. La diffusion anomale 3.1. Absorption des rayons X Variation du coefficient d’absorption L’absorption se mesure en fait par le coefficient d’absorption massique (µ/ρ), caractéristique de chaque élément chimique Il varie avec le numéro atomique Z et la longueur d’onde Variation de µ/ρ en fonction de la longueur d’onde variation brutale au niveau des longueurs d’ondes d’émission correspondant à l’énergie nécessaire pour extraire des électrons d‘une couche donnée Ces discontinuités correspondant aux énergies d'extraction des électrons des couches K, L1, L2, etc…

3. La diffusion anomale 3.1. Absorption des rayons X Application de l’absorption des rayons X Résolution de structures de macromolécules en cristallographie biologique Donc lorsque incident  seuil : Le phénomène d’absorption n’est plus négligeable Pour incident  1 Å, seuls les atomes lourds présentent une absorption non négligeable DIFFUSION ANOMALE Seuil d’absorption

3. La diffusion anomale 3.2. Le facteur de diffusion atomique Dans l’expression du facteur de diffusion fj, on néglige l’attraction du noyau sur les électrons (on les considère libres) Un calcul plus rigoureux impose une correction par rapport à la diffusion d’un électron libre Modèle de l’électron libre Modèle réel : Diffusion anomale absorption Le facteur de diffusion atomique est complexe fj = facteur de diffusion de l’atome j fj = f° f0 fj = facteur de diffusion de l’atome j fj = f° + f’ + i f" f" f’ f0 f’ : terme dispersif f" : terme d’absorption

3. La diffusion anomale 3.2. Le facteur de diffusion atomique Dès que f’ et f’’ ne sont plus négligeables = diffusion anomale C’est le cas lorsque incident  seuil Pour incident  1 Å, seuls les atomes lourds présentent une absorption non négligeable Variation en fonction de la résolution λ (Å) 34 fo Se f" E (eV) 6 résolution A haute résolution la diffusion anomale est plus importante fo diminue f’ et f" quasi-constants

3. La diffusion anomale 3.3. Conséquence de la diffusion anomale Pour les atomes lourds fa = f°a + f’a + i f"a On pose fa = f°a + f’a Im F F’’a F = foP e iP + (fa + if"a) e ia F = fP e iP + fa e ia + if"a e ia F = Fp + Fa + iF"a FPH F Fa FP Re F -FP -F -Fa a + ib Fp Fa i(a - ib) i(a + ib) F"a -F’’a a - ib

3. La diffusion anomale 3.3. Conséquence de la diffusion anomale FPH F Im F F’’a FPH F Fa Im F F’’a -F’’a FPH FP Re F F Fa -F -FP FP Re F -F -Fa -F’’a La loi de Friedel n’est plus respectée

3. La diffusion anomale 3.4. Principe de la méthode Fano = Fhkl  F-h –k -l Il est basé sur la modification de la diffraction lorsqu’un ou plusieurs diffuseurs anomaux sont présents dans le cristal, cad sur la différence d’intensité d’une paire de Bijvoet On définit la fonction de Patterson suivante P(uvw) =  (Fano )2 cos (2(hu + kv + lw)) avec ΔFano = Σ ΔF’’ Fonction de Patterson définissant une carte dont les pics sont les vecteurs interatomiques entre diffuseurs anomaux uniquement =

3. La diffusion anomale 3.4. Principe de la méthode Les diffuseurs anomaux sont localisés dans la section de Harker La déconvolution de la fonction de Patterson ou les méthodes directes permet de déterminer les positions des diffuseurs anomaux 1 Cartes de Patterson (unité asymétrique) de différence anomale expérimentale Groupe d’espace P21 u 1/2 w fA xA,yA,zA FAcalc, φAcalc TF

3. La diffusion anomale 3.5. Méthodologie Introduction de diffuseurs anomaux dans le cristal ou directement dans la protéine Atomes lourds Développements de cette technique : utilisation de la sélénométhionine méthionine sélénométhionine C C 34 e- S 16 e- Protéine Native Protéine Séléniée

3. La diffusion anomale 3.5. Méthodologie Production et cristallisation de la protéine modifiée Détermination de la longueur d’onde pour laquelle l’absorption est maximale le signal anomal est maximal Mesure d’un spectre de fluorescence du cristal La fluorescence est directement proportionnelle à l’absorption Enregistrement d’espaces complets ET redondants A partir d’un seul cristal Détermination de la position des diffuseurs anomaux Affinement des paramètres des diffuseurs anomaux Calcul des phases sous la forme de probabilité de phase Calcul d’une carte de densité électronique

3. La diffusion anomale (1) SAD : Single Anomalous Dispersion 3.5. Méthodologie (1) SAD : Single Anomalous Dispersion Collecte d’un jeu de données à 1 longueur d’onde : on se place à la longueur d’onde pour laquelle f" est maximal Pb : ambiguïté sur les phases (voir 3.6), méthode efficace uniquement pour des données de bonnes qualités (2) MAD : Multiple Anomalous Dispersion Collecte de 3 jeux de données à 3 longueurs d’onde 1. f" maximal 2. f’ maximal 3. loin du seuil d’absorption (pas d’effet anomal)

3. La diffusion anomale FP ? tels que 3.6. Détermination des phases Im F F’’a -F’’a FPH FP ? tels que F Fa -F FP Re F F+ = Fp + Fa + iF"a F- = Fp + Fa - iF"a modules de F+ modules de F- modules et phases de Fa modules et phases de F"a On dispose de : Construction de Harker

3. La diffusion anomale 3.6. Détermination des phases H K FPL(-) axe imaginaire H FPL(+) K F"L -F"L axe réel FPL(-) -F’L O Pour chaque réflexion hkl Construction de Harker

3. La diffusion anomale 3.6. Détermination des phases H K FPL(-) axe imaginaire H A partir de la position des diffuseurs anomaux, on peut déterminer φP pour chacune des réflexions FP, φP xP,yP,zP TF-1 FPL(+) K F"L -F"L FPL(-) -F’L O

3. La diffusion anomale Avantages Un seul cristal est nécessaire 3.7. Conclusions Avantages Un seul cristal est nécessaire - pas de défaut d’isomorphisme La sélénométhionine, ou tout diffuseur anomal lié covalemment, est un point d’ancrage pour la construction de la structure - pas de problème d’occupation Phasage à haute résolution

3. La diffusion anomale Inconvénients 3.7. Conclusions Inconvénients Signal anomal faible par rapport aux intensités collectées - il faut 1 Me pour 8 kDa L’accès aux sources synchrotron est nécessaire - utilisation de Gd sur anode tournante

3. La diffusion anomale SIRAS, MIRAS Erreurs sur les phases 3.7. Conclusions Erreurs sur les phases Calcul des phases par distribution Gaussienne de probabilité de phase Combinaison des méthodes Remplacement isomorphe et diffusion anomale SIRAS, MIRAS Erreurs sur les phases Calcul des phases par distribution Gaussienne de probabilité de phase Combinaison des méthodes remplacement isomorphe et diffusion anomale SIRAS, MIRAS

4. LE REMPLACEMENT ISOMORPHE

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Il est basé sur le changement d’intensité causé par la présence d’un atome lourd dans la molécule (FH, H) Atome lourd cristal dérivé cristal natif « cristal différence » cristal virtuel FPH FP FH

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Hypothèse de base le cristal de la structure native et du dérivé lourd doivent être isomorphes : la symétrie cristallographique et les paramètres de maille sont conservés la molécule n’a subi ni rotation ni translation dans la maille pour pouvoir générer le « cristal différence »

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Pour chaque réflexion hkl Fhkl = P fP e 2i (hxP + kyP + lzP) + H fH e 2i (hxH + kyH + lzH) FP e i P FH e i H Atomes lourds Atomes légers FPH = FP + FH FPH = facteur de structure du cristal dérivé FH = facteur de structure des atomes lourds FP = facteur de structure de la protéine

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Il faut disposer de plusieurs jeux de données : - jeu natif = cristal de protéine seule (FP) - un ou plusieurs dérivés lourds = cristaux de protéine + atomes lourds (FPH) Hypothèse de base Si les cristaux sont isomorphes, les FP sont les mêmes dans le cristal natif et dans les cristaux de dérivés lourds l FP = P fP e 2i (hxP + kyP + lzP) FPH = P fP e 2i (hxP + kyP + lzP) + H fH e 2i (hxH + kyH + lzH)

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie Préparation des cristaux de dérivés lourds Enregistrement espaces complets de diffraction de la structure native du (des) dérivé(s) lourd(s) Mise à l’échelle des jeux natif/dérivé(s) Détermination de la position des atomes lourds Affinement des paramètres des atomes lourds Calcul des phases (probabilité de phases) Calcul d’une carte de densité électronique

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie Obtention des dérivées lourds Classiquement obtenus par trempage des cristaux Les composés lourds diffusent dans le cristal à travers les canaux de solvant Ils peuvent se fixer sur des sites précis Ex : composés Hg réagissent avec les Cys accessibles et réduites à pH neutre Cette étape est souvent longue et fastidieuse Autre méthode possible : incorporation d’un atome lourd avant cristallisation Ex : Sélenométhionine cf diffusion anomale

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie Choix des atomes lourds Kit Hampton Research

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie L’incorporation de l’atome peut perturber l’empilement cristallin défaut d’isomorphisme Lorsque le défaut d’isomorphisme est important, les FP ne sont plus équivalents Le défaut d’isomorphisme augmente avec la résolution En général : Trouver la zone de résolution pour laquelle le cristal dérivé est isomorphe

4. Le remplacement isomorphe 4.3. Détermination de la position des atomes lourds a b Protéine native Atome lourd Protéine substituée (« isomorphe »)

4. Le remplacement isomorphe 4.3. Détermination de la position des atomes lourds FPH = FP + FH Fiso = FPH  FP On définit la fonction de Patterson suivante : P(uvw) =  (Fiso )2 cos (2(hu + kv + lw)) avec (Fiso )2 ~ |FH|2 Fonction de Patterson définissant une carte dont les pics sont les vecteurs interatomiques entre atomes lourds « uniquement » Calculée sur les données de diffraction issues de 2 cristaux (natif et dérivé) =

4. Le remplacement isomorphe 4.3. Détermination de la position des atomes lourds Les atomes lourds sont localisés dans la section de Harker La déconvolution de la fonction de Patterson permet d’avoir la position des atomes lourds Exemple : P21 2 pics dans la section de Harker v = 1/2 dus à 1 atome lourd 2x 1/2 2z -2x 1/2 -2z fH xH,yH,zH FHcalc, φHcalc TF

4. Le remplacement isomorphe 4.4. Détermination des phases FP ? tels que FPH = FP + FH Axe imaginaire H FP FH J -FH O Axe réel On dispose de : G module de FP module et phase de FH module de FPH FPH Construction de Harker

4. Le remplacement isomorphe 4.4. Détermination des phases FPH2 Axe imaginaire FP,φP H FP Avec un deuxième dérivé, on lève l’ambiguïté de phase FH -FH2 J -FH O Axe réel G FPH

4. Le remplacement isomorphe 4.4. Détermination des phases Pour chacune des réflexions on peut déterminer φP 2 méthodes SIR : « Single Isomorphous Replacement » 1 cristal natif + 1 seul cristal dérivé MIR : « Multiple Isomorphous Replacement » 1 cristal natif + Plusieurs cristaux dérivés (>2) Remarque : on peut combiner remplacement isomorphe et diffusion anomale (voir diapo suivante) FP, φP xP,yP,zP TF-1

4. Le remplacement isomorphe 4.5. Combinaison des 2 méthodes axe imaginaire Principe de la méthode SIRAS H FPH(+) FP K F"H -F"H axe réel FPH(-) -F’H O 1 cristal natif 1 cristal dérivé contenant des atomes lourds qui sont diffuseurs anomaux

4. Le remplacement isomorphe 4.6. Erreurs sur les phases Sources d’erreurs - coordonnées (x,y,z) des atomes lourds - amplitudes des F mesurés (FP et FPH) - défaut d’isomorphisme Erreur de fermeture : hypothèse : FPH + ε ε ε = |FPHobs| - |FPHcalc| ε = |FPHobs| - |[|FP|eiφP + |FH| eiφH] FPH FH FP Les erreurs sont traitées avec des méthodes statistiques L’erreur de fermeture est utilisée pour définir une probabilité de phase (voir document)

4. Le remplacement isomorphe 4.6. Erreurs sur les phases Hypothèse : les erreurs sont distribuées selon une Gaussienne P Cas du SIR φbest FP 70 330 Probabilité d’une phase de présenter une certaine valeur S’il y a n dérivés, les probabilités de phase des différents dérivés sont multipliées

4. Le remplacement isomorphe 4.6. Erreurs sur les phases La qualité de l’information sur chaque phase est mesurée par la figure de mérite (m ou fom) qui est le reflet de l’étroitesse de la distribution de probabilité : - m = 1 : distribution étroite - m = 0 : distribution plate φbest = 200 ° m = 0.23 φbest = 328 ° m = 0.95 Δφ = 76 ° Δφ = 18 ° 3 dérivés m = cos Δφ 330 centroïde de la distribution = phase la meilleure φbest Cartes de densités mhkl Fp e i αbest