Projet Génie Biologique Troisième Année Nouvelles stratégies pour faire face à la résistance des bactéries aux antibiotiques Laurent Guillaud Fabienne Le Bouteiller Céline Martineau Hélène Mauboussin Alain Medawar Jian-Chun Sun Romain Viaux-Cambuzat Chef de projet : Fabienne Degroote 27 janvier 2005

Introduction Nouvelles stratégies pour faire face à la résistance des bactéries aux antibiotiques Un problème d’actualité Recherche de solutions techniques Aspects industriels et perspectives 22 27 janvier 2005

Introduction Objectifs de la soutenance Sommaire Apporter une vision complémentaire Mettre en évidence les enjeux Sommaire Evaluation d’un agent anti-microbien Un exemple: les peptides anti-microbiens Développement et Mise en application dans la société moderne 27 janvier 2005

Plan Introduction Évaluation d’un agent anti-microbien Différents critères pris en compte Comparatif  des stratégies Peptides anti-microbiens Types et Modes d’action Origines et Motivations Exemples d’organismes Techniques rapides d’identification microbienne Mise en application et rôle de l’État Entomed Rôle de l’État dans l’aide aux entreprises innovantes Influence de l’État sur la population Conclusion 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien Différents critères pris en compte 27 janvier 2005

Émergence de la résistance Évaluation d’un agent anti-microbien Émergence de la résistance Adaptation de la bactérie (rôle de la pression de sélection, du mode d’action, de la largeur du spectre) Enrayée par Arrêt de prescription lors de l’apparition Limitation de prescription de produits à large spectre Hygiène 27 janvier 2005

Largeur du spectre d’action Évaluation d’un agent anti-microbien Largeur du spectre d’action Définition Ne prend pas en compte la résistance 4 classes pour les espèces bactériennes Espèces habituellement sensibles Espèces modérément sensibles Espèces inconstamment sensibles Espèces résistantes 27 janvier 2005

Effet Définition Bactériostatique : Concentration Minimale Inhibitrice Évaluation d’un agent anti-microbien Effet Définition Bactériostatique : Concentration Minimale Inhibitrice Bactéricide : Concentration Minimale Bactéricide Antipathogénique 27 janvier 2005

Obtention Recherche & Développement : - Cribler l’agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien Obtention Recherche & Développement : - Cribler l’agent anti-microbien - Modifications Production 27 janvier 2005

Immunogénicité / Toxicité Évaluation d’un agent anti-microbien Immunogénicité / Toxicité Risque d’allergie Utilisation de molécules de défense Toxicité potentielle chez l’homme Ex: mélittine (abeille), pardaxine (poisson) 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien Comparatif des stratégies 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Bactériophages Résistance Oui : mode d’action, infections chroniques Spectre Etroit Effet Bactéricide, mais population résiduelle Obtention Facile, production peu coûteuse Immuno- génicité Oui (potentiellement) 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Peptides antimicrobiens Résistance Peu probable Spectre Variable Effet Bactéricide, mais population résiduelle Obtention Démarche relativement longue Immuno- génicité Toxicité dans certains cas 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Sérothérapie Résistance Non Spectre Culture cellulaire: étroit Extraction sur l’homme : variable Effet Bactéricide Obtention Réalisation complexe à grande échelle Immuno- génicité Non, mais problèmes liés à la transfusion 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Motifs CpG Résistance Non : stimulation du système immunitaire Spectre Large Effet Indirectement bactéricide Obtention Simple Immuno- génicité Problèmes liés aux médicaments ADN 27 janvier 2005

Inhibition du Quorum Sensing Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Inhibition du Quorum Sensing Résistance Peu probable Spectre Étroit Effet Antipathogénique Obtention Difficile, mais mécanismes proches Immuno- génicité Non 27 janvier 2005

Évaluation d’un agent anti-microbien Solution Bactériophages Peptides anti-microbiens Sérothérapie Motifs CpG Inhibition QS Résistance Oui Non Spectre Variable Large Étroit Effet Bactéricide Indirectement Bactéricde Antipatho-génique Obtention Facile Difficile Immuno- génicité variable Critère

Bilan Grande diversité des solutions envisagées Évaluation d’un agent anti-microbien Bilan Grande diversité des solutions envisagées Chaque solution est un bon candidat Nécessité de recherches : Validation du produit dans le cas considéré Mise en place d’une action planifiée et raisonnée 27 janvier 2005

Peptides Anti-microbiens 27 janvier 2005

Peptides Anti-microbiens Types et Modes d’action 27 janvier 2005

Généralités Petites molécules endogènes Peptides anti-microbiens Généralités Petites molécules endogènes Effet anti-microbien à spectre étroit Altération de la membrane bactérienne 27 janvier 2005

Mode d’action général Perturbation de la membrane Peptides anti-microbiens Mode d’action général Attraction électrostatique + + + + + Perturbation de la membrane - - - - - Insertion bioénergétique et interaction 27 janvier 2005

3 catégories Peptides anti-microbiens anioniques Peptides anti-microbiens cationiques Peptides fragments de protéine 27 janvier 2005

Peptides anioniques Dans les tissus pulmonaires, le foie et Peptides anti-microbiens Peptides anioniques Dans les tissus pulmonaires, le foie et l’intestin grêle de bovins et d’ovins Complexés à du zinc, leur efficacité augmente Mode d’action inconnu Théorie : Zn+ Zn+ Mort Zn+ Zn+ Ribo nucléase 27 janvier 2005 Bactérie

Peptides cationiques Linéaires riches en Proline Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Composition très variable Classés en 3 catégories : Grand nombre d ’Arginine et de Lysine Domaine C-terminal variable : cationique anti-microbien Linéaires riches en Proline Linéaires avec hélice  Avec cystéines stabilisantes 27 janvier 2005

Peptides cationiques Peptides linéaires avec hélice  Amphiphiles Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Peptides linéaires avec hélice  Amphiphiles Perméabilisation de la membrane Exemple : Cécropine P1 (intestin de porc) Activité anti-bactérienne très rapide Contre les bactéries Gram négatif Interaction avec phospholipides membrannaires Déstabilisation de la membrane 27 janvier 2005

Peptides cationiques Peptides linéaires riches en Proline Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Peptides linéaires riches en Proline Contiennent un grand nombre d ’Arg, Gly et Trp Exemple : PR-39 (intestin de porc) Contre les bactéries Gram négatif Inhibe la NADPH oxydase des neutrophiles Toxique pour l’homme PR-39 Mort PR-39 Salmonella cholerasuis 27 janvier 2005

Peptides cationiques Peptides avec cystéine stabilisante Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Peptides avec cystéine stabilisante Ponts disulfure Feuillets  stables Exemple :  - défensines Neutrophiles de certains mammifères Stockées dans granulocytes Contre les bactéries Gram négatif, Gram positif et virus  - défensines de volailles > 90% efficaces contre E.coli et Listéria monocytogenes 27 janvier 2005

Peptides fragments de protéines Peptides anti-microbiens Peptides fragments de protéines Domaines anti-microbiens résidant dans des protéines Produits d’une digestion enzymatique naturelle Exemple : Lactoferricine Dégradation partielle de Lactoferrine Contre bactéries de la lumière gastro-intestinale Peptide anti-microbien 27 janvier 2005

Potentiel thérapeutique Peptides anti-microbiens Potentiel thérapeutique Bons résultats in vitro Pourraient être efficaces in vivo 2 études avec des moutons présentant une pneumonie aïgue par Mannheimia hæmolytica Diminution de [bactéries] Réduction de l’inflammation Traitements et prévention d’infections pulmonaires Besoins d’études plus poussées pour confirmation 27 janvier 2005

Les recherches futures Peptides anti-microbiens Les recherches futures Séquençage futur de génomes d’animaux nouveaux peptides antimicrobiens Exemple : ß-défensines découvertes chez l’homme et la souris Animaux transgéniques sources de peptides anti-microbiens Lactoferrine de vache transgénique Commercialisée au Japon : Alicament 27 janvier 2005

Bilan Peptides anti-microbiens : Traitements des infections Possibilité d’augmenter leur production chez les animaux Utilisation de virus contenant un gène de peptide anti-microbien Co-administration avec des vaccins 27 janvier 2005

Peptides Anti-microbiens Origine et motivations 27 janvier 2005

Origine Système immunitaire inné Système immunitaire adaptatif Peptides anti-microbiens Origine Système immunitaire inné Récepteurs spécifiques invariants Contre motifs structuraux microbiens (LPS,…) Système immunitaire adaptatif Récepteurs de la super-famille des IgG Contre tout corps du non soi Rapidité de réponse de la voie innée Performance des peptides anti-microbiens dans la réponse immunitaire 27 janvier 2005

Motivations : Étude phylogénique Peptides anti-microbiens Motivations : Étude phylogénique Compréhension des mécanismes biologiques fondamentaux Bonnes perspectives d’application thérapeutique Présents chez tous les métazoaires et certains organismes unicellulaires Microorganismes Plantes Animaux Invertébrés Vertébrés Peptides Anti-microbiens 27 janvier 2005

Peptides Anti-microbiens Exemples d’organismes 27 janvier 2005

Exemple 1: Les bactéries Peptides anti-microbiens Exemple 1: Les bactéries Entérobactéries - Klebsiella pneumoniæ Microcines E492 Actif contre Gram - 27 janvier 2005

Exemple 2: Les poissons Plie rouge Saumon Pleurocidine Hépcidine Peptides anti-microbiens Exemple 2: Les poissons Plie rouge Saumon Pleurocidine Hépcidine Perspectives : -Transgénèse chez les poissons -Renforcement de l’état larvaire 27 janvier 2005

Exemple 3: Les annélides Peptides anti-microbiens Exemple 3: Les annélides Sangsue Synthèse et stockage : cellules graisseuses 4 peptides Actifs contre les Gram + Originalité : Stimulation par infection microbienne 27 janvier 2005

Exemple 4: Les mammifères Peptides anti-microbiens Exemple 4: Les mammifères Porc Synthèse et stockage : Leucocytes, cellules épithéliales + 12 peptides Spectre variable Perspective : -Transgénèse dans la luzerne : β-défensine -Agent thérapeutique naturel pour le bétail 27 janvier 2005

Exemple 5: Les amphibiens Peptides anti-microbiens Exemple 5: Les amphibiens Batraciens anoures Synthèse et stockage : Glandes granuleuses Pré-pro- dermaseptines Spectre variable Perspectives : -Dermaseptines B et S : non toxiques pour l’homme -Synthèse chimique 27 janvier 2005

Exemple 6: Les insectes Drosophile 7 peptides Synthèse et Stockage : Peptides anti-microbiens Exemple 6: Les insectes Drosophile Synthèse et Stockage : Corps gras 7 peptides Spectres spécifiques Perspectives : -Applications sur les insectes utiles ou nuisibles -Applications thérapeutiques 27 janvier 2005

Bilan des exemples Étude des êtres vivants Peptides anti-microbiens Bilan des exemples Sources multiples de peptides Étude des êtres vivants Découverte de peptides à haut potentiel thérapeutique 27 janvier 2005

Peptides Anti-microbiens Techniques rapides d’identification microbienne 27 janvier 2005

Protocole de traitement Peptides anti-microbiens Protocole de traitement Prélèvement Malade Identification du germe Prescription Choix du peptide anti-microbien 27 janvier 2005

Caractéristiques recherchées Peptides anti-microbiens Caractéristiques recherchées Rapide Simple Identification Automatisée Fiable 27 janvier 2005

Techniques rapides d’identification microbienne Peptides anti-microbiens Techniques rapides d’identification microbienne Tests d’hybridation moléculaire PCR quantitative Cytométrie de flux 27 janvier 2005

Tests d’hybridation moléculaire Peptides anti-microbiens Tests d’hybridation moléculaire LUMIprobe 24® (Europrobe / Euralam) Principe: hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN révélation du signal de l’hybride formé Rapidité < 24h Spécificité Sonde ADN / ARNr germe ciblé Simplicité d’utilisation 27 janvier 2005

PCR quantitative GeneSystem® (GeneSystems) GeneDisc Cycler GeneExtract Peptides anti-microbiens PCR quantitative Principe: amplification de l’ADN avec amorces choisies analyse quantitative GeneSystem® (GeneSystems) GeneDisc Cycler Automate GeneExtract Extracteur d’ADN bactérien GeneDisc 27 janvier 2005

Traçabilité des résultats Peptides anti-microbiens PCR quantitative Rapide (3 à 24h) Standardisée Simple Traçabilité des résultats 27 janvier 2005

Cytométrie de flux Principe Peptides anti-microbiens Échantillon Marqueurs Laser Signal Propriétés de la cellule analysée 27 janvier 2005

Cytométrie de flux Rapidité << 24h 30 000 cellules/s Sensibilité Peptides anti-microbiens Cytométrie de flux Rapidité << 24h 30 000 cellules/s Sensibilité Multiparamétrique Quantitative Fiabilité Automatisé reproductibilité traçabilité 27 janvier 2005

- + Bilan Limité à l’agroalimentaire Peu d’espèces identifiables Coût Peptides anti-microbiens Bilan Limité à l’agroalimentaire Peu d’espèces identifiables Coût Utilisation en routine Utilisation en analyse clinique envisageable - + 27 janvier 2005

Mise en application et rôle de l’État 27 janvier 2005

Mise en application et rôle de l’État Entomed 27 janvier 2005

Présentation Entreprise de Biotechnologie Créée en 1999 Mise en application et rôle de l’État Présentation Entreprise de Biotechnologie Créée en 1999 R&D et Production Peptides anti-microbiens Dérivés de la réponse immunitaire d’insectes Mutagenèse dirigée Entomed est une jeune entreprise de biotechnologies créée en 1999 et se situant à l’ESBS. Elle effectue des recherches, développe et tente de produire des peptides antimicrobiens à spectre étroit. En effet, comme nous l’avons dit précédemment, ces derniers pourraient être une nouvelle voie de thérapie contre les maladies infectieuses. Ils sont dérivés de molécules générées par la réponse immunitaire des insectes, et sont modifiées par mutagenèse dirigée afin d’améliorer leur activité antimicrobienne. 27 janvier 2005

Ministère délégué à la Recherche Mise en application et rôle de l’État Subventions Création Activité Ministère délégué à la Recherche ANVAR Entomed a pu profiter de l’aide de l’État grâce à deux acteurs : le Ministère délégué à la Recherche et l’ANVAR, qui est l’Agence Française de l’Innovation. Ces aides ont été apportées à deux niveaux. Tout d’abord au moment de la création de l’entreprise qualifiée d’innovante, puis en raison de l’activité d’Entomed, qui est liée à la résolution d’un problème de santé public. 27 janvier 2005

Problèmes rencontrés Produit Rentable ? Mise en application et rôle de l’État Problèmes rencontrés Produit Rentable ? Utilisation spécifique à une espèce Marché visé restreint Coûts de production élevés Cependant, malgré ces aides, Entomed a rencontré certains problèmes lors du développement du procédé de production de son premier peptide antimicrobien. En effet, celui-ci ayant un spectre d’action étroit, les études de marché réalisées en parallèle ont montré que le marché visé était trop restreint. De plus, les coût liés à la production de ce peptide recombinant étaient trop élevés par rapport à la disponibilité du marché. La question s’est donc posée de savoir si le produit serait rentable et si Entomed était prête à prendre le risque de se lancer dans cette production. 27 janvier 2005

Choix stratégiques En Externe En Interne Pas de production de peptides Mise en application et rôle de l’État Choix stratégiques En Interne Pas de production de peptides Production de molécules plus rentables En Externe Recherche de partenaires pour la production de peptides Ils ont donc dû réaliser des choix stratégiques et ont finalement décidé de na pas produire de peptide antimicrobien en interne mais plutôt de rechercher des partenaires pour cette production. Cependant, afin de générer du capital et de continuer leurs recherches initiales, ils ont axé leur production sur de petites molécules ayant des activités diverses et produites par synthèse chimique. 27 janvier 2005

Mise en application et rôle de l’État Rôle de l’État dans l’aide aux entreprises innovantes Nous allons maintenant vous présenter le rôle joué par l’État dans aide aux entreprises innovantes. 27 janvier 2005

Création d’entreprises innovantes Mise en application et rôle de l’État Création d’entreprises innovantes Future Entreprise ANVAR 40 % de l’activité Lors de la création d’une entreprise, la majorité des aides directes est apportée par l’ANVAR, qui y consacre 40 % de son activité. Cet organisme gouvernemental participe entre autres à la mise en place et au financement du concourt national d’aide à la création d’entreprises de technologies innovantes. Les entreprises lauréates peuvent ainsi acquérir une bourse de faisabilité du projet ou une bourse de création-développement, lorsque leur projet est déjà mis en place. Concours National Bourse de Faisabilité Bourse de Création-développement 27 janvier 2005

Accompagnement personnalisé Mise en application et rôle de l’État Accompagnement personnalisé Expertise Recherche de partenaires Promotion de l’innovation L’accompagnement personnalisé proposé par l’ANVAR est effectif pendant plusieurs années. Il débute par l’évaluation et la structuration du projet au travers d’expertises. Par la suite, il aide l’entreprise à rechercher des partenaires grâce à son réseau d’acteurs économiques, financiers et technologiques. Enfin, l’ANVAR mène des actions de promotion pour faire connaître les projets qu’elle a soutenu. 27 janvier 2005

Différentes aides de l’ANVAR Mise en application et rôle de l’État Différentes aides de l’ANVAR Subventions 28 % Avances remboursables 66 % Les différentes aides proposées par l’ANVAR se classent en trois catégories. Les avances remboursables sont les plus fréquemment allouées. Elles représentent 66 % des aides et correspondent en réalité à des prêts à 0 % faits aux jeunes entreprises dont le projet est jugé en bonne voie de réalisation. Les subventions, représentant 28 % des aides, correspondent à des dons financiers et les bons de souscription d’actions représentent des actions achetées à l’entreprise. Bons de Souscription d’Actions 6 % 27 janvier 2005

Politique en faveur de l’innovation Mise en application et rôle de l’État Politique en faveur de l’innovation Société Capital Risque Unipersonnelle Création d’un statut « jeune entreprise innovante » Co-financement des incubateurs publics Fonds spécialisés dans la création d’entreprises Le Ministère délégué à la Recherche et aux Nouvelles Technologies a mis en place une politique en faveur de l’innovation. Tout d’abord, un statut a été créé pour les investisseurs individuels dans les jeunes entreprises, ou business angels : la société de capital risque unipersonnelle. Ce statut permet à la scru et à l ’entreprise de profiter d’avantages fiscaux. 27 janvier 2005

Mise en application et rôle de l’État Influence de l’État sur la population 27 janvier 2005

Les antibiotiques, des médicaments pas comme les autres Mise en application et rôle de l’État Les antibiotiques, des médicaments pas comme les autres Mauvais usage des antibiotiques Un médicament efficace contre tout ? Respect de l’ordonnance non nécessaire Une pression de la part des patients sur leur médecin Automédication respect de la durée du traitement,respect des doses prescrites, respect du rythme de prise du médicament 27 janvier 2005

Une meilleure information Mise en application et rôle de l’État Une meilleure information Auprès des médecins Tables rondes Questionnaires Auprès des patients « Les antibiotiques c’est pas automatique » Mise à disposition de dépliants dans les cabinets médicaux Sites Internet médicaux grand public "maladie infectieuse courante = antibiotiques" 27 janvier 2005

Les solutions mises en oeuvre Mise en application et rôle de l’État Les solutions mises en oeuvre Étude « regards croisés » d’IPSOS « Propositions pour un plan national pour préserver l’efficacité des antibiotiques 2001-2005 » Programme de gestion du risque de l’Assurance maladie Test de diagnostique rapide de l’angine Test de gastroentérite virale : Vikia® 27 janvier 2005

Une baisse encourageante Mise en application et rôle de l’État Une baisse encourageante 27 janvier 2005

Conclusion Plusieurs alternatives Peptides anti-microbiens Techniques d’indentification rapides Productions envisagées Nécessité d’implication Problème de rentabilité 27 janvier 2005

Utilisation Conclusion Développement État Public Aides Demande Sensibilisation 27 janvier 2005