Répression Génique induite par les ARN RNA-induced Gene Silencing Karim BOUHIDEL Master 2 PPB - 2008

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 Andrew Z. Fire Stanford University School of Medicine USA Craig C. Mello University of Massachusetts Medical School USA "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

Répression Génique Induite par les ARN Mécanisme de régulation génique qui limite le taux de transcription par: • Blocage de la Transcription (TGS: Transcriptional gene silencing) • Activation d’un processus de Dégradation Spécifique des Transcrits (PTGS: Post Transcriptional Gene Silencing)

Une Multitude de Dénominations • PTGS: Posttranscriptional Gene Silencing • TGS: Transcriptional Gene Silencing • Cosuppression (plantes) • Quelling (champignons) • VIGS: Virus-Induced Gene Silencing • RNAi: RNA interférence (animaux) Noms donnés à des phénomènes présentant des similitudes, mais pas identiques, observés dans différents organismes, ou au sein d’un même organisme

dès 1928 • Tabac infecté par le TRV (Tobacco Ringspot Virus) • Nécrose au niveau des feuilles initialement infectées • Feuilles supérieures immunes au virus • Mécanisme de résistance ?

Les Grandes Fonctions Biologiques • Défense contre les Virus • Protection contre les Transposons • Structuration des Chromosomes • Régulation de l’Expression des gènes

Découverte (Jorgensen et Mol – 1990) • Accentuation de la couleur pourpre des fleurs de Petunia • Introduction du gène codant la chalcone synthase • Effet inverse: Plantes variéguées ou blanches • Transgène Inactif • Gène Endogène Inactivé • Phénomène appelé: Cosuppression • Mécanisme: Dégradation d’ARN transcrits à des loci distincts mais homologues

Un Phénomène Ubiquiste RNAi + • Chez les champignons appelé Quelling • Chez Caenorhabditis elegans appelé RNA Interférence (RNAi) • Chez les plantes: Inductibles également par des virus appelé Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) RNAi -

Caractéristiques Majeures • L’inducteur est un ARN double brin (dsRNA) • Il y a production de petits ARN (siRNA, miRNA …) • La cible ARN est dégradée (neutralisée) par un processus "homologie-dépendant" • La machinerie de dégradation requière un ensemble de protéines similaires en structure et fonction dans la plupart des organismes

Inhibition traduction Dégradation ARNm Les Grandes Etapes dsRNA Étape d’initiation Dicer siRNA Étape effectrice RISC Inhibition traduction Dégradation ARNm

Composantes Moléculaires DICER • Enzyme de type RNAse III spécifique des dsRNA • Produit des siRNA de taille identique • Famille de nucléases ATP-dependantes • Nématode (1), la Drosophile (2), Arabidopsis (4), l’Homme (1) • Monomérique ? Dimérique ? • Reticulum endoplasmique (Homme) • Perte de Dicer: - anomalies de développement (Drosophile, Arabidopsis) - léthalité embryonnaire chez la souris

Composantes Moléculaires DICER Domaines structuraux ? Piwi/Argonaute/Zwille liaison dsRNA ? Modèle de catalyse • Liaison du domaine PAZ domain avec l’extrémité 3′ protubérante du dsRNA • Les domaines RNaseIII forment un pseudo-dimère. • Chaque domaine hydrolyse un brin et recrée une protubérance simple brin de 2N. • La longueur de 21bp est la conséquence de la distance entre le domaine PAZ et le site actif.

Composantes Moléculaires Les petits ARN interférents (siRNA) dsRNA de 21 à 25N • Phosphate 5’ • Hydroxyle 3’ • Extension 3’ de 2 nucleotides Pas requises pour la répression. Permettraient la séparation des 2 brins ? Promotion assemblage complexe RISC ?

Composantes Moléculaires Les petits ARN interférents (siRNA) • Choix du simple brin dépend de la stabilité de l’appariement aux extrémités • Brin dont l’extrémité 5’ est la moins fortement appariée à son complément

Composantes Moléculaires RNA-Induced Silencing Complex (RISC) • Complexe protéique (140 à 500 kDa) à activité Endonuclease ATP-dépendante • 1 membre de la famille des protéines Argonaute • Autres protéines de fonctions inconnues • Une protéine Argonaute et un siRNA sont suffisants pour le clivage de la cible

Composantes Moléculaires Protéines Argonautes • Famille de nucléases séquence-spécifique qui utilise des petits ARN commme guides pour hydrolyser un messager (27 nématode, 10 Arabidopsis, 8 homme, 5 drosophile) • Interaction avec DICER lors du transfert du siRNA • Site de clivage de l’ARN cible est situé au milieu de la région liée au siRNA. • Domaines PAZ et PIWI (motif type RNase H) • 2 protéines cristallisées (Pyrococcus furiosus, Archaeoglobus fulgidus)

Composantes Moléculaires Protéines Argonautes Modèle de catalyse Ago 2 – RISC Appariement Extension - Clivage • Le brin guide du siRNA est liée par son extrémité 5’ au domaine PIWI et par son extrémité 3’ au domaine PAZ. • Cible mRNA liée à la région 5’ du siRNA et l’appariement s’étend en 3’. • Le domaine PIWI hydrolyse la cible à une distance mesurée à partir de l’extrémité 5’ du siRNA.

Composantes Moléculaires Mode d’action des siRNA Inhibition de la traduction Clivage Hétérochromatinisation Chromatine active Méthylation Chromatine inactive

Composantes Moléculaires RNA polymerase RNA-dépendante (RdRP ou RDR) • Synthèse d’un ARN double brin à partir d’une matrice simple brin • Famille de protéines (Arabidopsis 6, Neurospora 4,nématode 4) Absent des génomes de la drosophile et des mammifères. Activité RdRP chez embryon de drosophile • Amplifie le dsRNA et/ou les siRNA et accentue le processus de répression • Chez l’embryon de drosophile ~35 molécules de dsRNA peuvent éteindre un mRNA présent en plus de 1000 copies par cellule • Synthèses amorce-dépendante et amorce-indépendante

Composantes Moléculaires Amplification amorcée Mode d’Action de la RDR ARN normal Pas de répression ARN anormal Répression de novo ARN normal Amplification amorcée Clivage siRNA

Composantes Moléculaires microRNA (miRNA) • ARN simple brin de 22N généré par Dicer à partir d’un transcrit endogène de structure en épingle à cheveu 116 chez Caenorhabditis elegans 78 chez la drosophile 222 chez l’homme 112 chez Arabidopsis • Unité de transcription autonomes (RNA pol II) dans régions géniques (introns) et intergéniques (majorité). pré-miRNA du nématode

Composantes Moléculaires microRNA (miRNA) • Expression contrôlée au cours du développement et en fonction des tissus • pri-miRNA : microRNA primaire capé et polyadénylé • pré-miRNA : microRNA précurseurs exportés du noyau • Incorporés dans un complexe RISC particulier appelé miRNP pré-miRNA de plantes

Biogenèse des miRNA

Transcriptional Gene Silencing (TGS) Quatre processus médiés par des ARN double brin ont pour cible le génome nucléaire et induisent la répression de gènes • Méthylation de l’ADN médiée par un ARN (RdDM) • Hétérochromatinisation médiée par RNAi • Elimination de séquences intergéniques du macronoyau des ciliés • Répression méiotique de gènes non appariées chez Neurospora (lutte contre les transposons)

Transcriptional Gene Silencing (TGS) Méthylation de l’ADN médiée par un ARN (RdDM) Hétérochromatinisation médiée par RNAi • Modification covalente de cytosines dans l’ADN et des histones (méthylation lysine 9 de H3 - H3K9) • RdDM chez les plantes Hétérochromatinisation médiée par RNAi chez la levure, les plantes et les animaux • Tous les deux initiés par des dsRNA • Produits de 2 voies séparées ou d’une seule?

Transcriptional Gene Silencing (TGS) Méthylation de l’ADN médiée par un ARN (RdDM) • Montrée la 1ère fois dans des tabacs infectées par des viroïdes • Méthylation de novo de cytosines dans les promoteurs • Confinée dans la région d’homologie • Modification des histones maintient la méthylation de l’ADN • dsRNA produits par une ARN polymérase RNA-dépendante (RDR2) sur des matrices simple brin • Matrices transcrites de répétitions inverses par une RNA pol DNA-dépendante (polII)

Méthylation de l’ADN médiée par un ARN (RdDM) Mécanisme RdRP RDR2 Dicer DCL3 Méthylases MET1, DRM2, CMT3, SUVH4 (H3K9) Histone désacetylase HDA6 Argonautes AGO4, AGO1 Facteurs modelant la chromatine DDM1, DRD1 DNA glycosylases DME, ROS1

Hétérochromatinisation médiée par RNAi • Hétérochromatine: peu de gènes, répétitions en tandem de séquences courtes, Transposons dégénérés • Régions centromériques et péricentromériques • Schizosaccharomyces pombe : RNAi mutants Dérépression des transposons dans les régions péricentromériques

Hétérochromatinisation médiée par RNAi Production de dsRNA par des séquences répétées

Hétérochromatinisation médiée par RNAi • Dicer produit à partir des dsRNA des petits ARN (rasiRNA) • Ils s’incorporent dans un variant du complexe RISC appelé RITS (RNA-induced transcriptional silencing complex) • Méthyl-transférase Clr4 et désacétylase inconnue (HDAC) catalysent la méthylation de H3K9 • Interaction ARN-ADN ou ARN-ARN ? • Forme modifiée de H3 se lie à Swi6 (protéine d’hétérochromatine) et recrute la cohésine Rad21

Répression Génique Induite par les ARN Schéma de synthèse

Répression Génique induite par les ARN RNA-induced Gene Silencing Karim BOUHIDEL Master 2 PPB - 2008

Dégradation ARNm Inhibition Traduction Hétérochromatinisation Les Grandes Etapes dsRNA Étape d’initiation Dicer siRNA/miRNA/rasiRNA Étape effectrice RISC/miRNP/RITS Dégradation ARNm Inhibition Traduction Hétérochromatinisation

/ miRNP / miRNP

Répression Génique Induite par les ARN Un Bilan • Régulation de l’Expression des gènes miRNA/miRNP • Structuration des Chromosomes rasiRNA/RITS • Système de Défense contre des agents invasifs: - Virus : siRNA/RISC - Transposons : rasiRNA/RITS

Répression Génique Induite par les ARN Un Bilan Régulation de l’expression des gènes (miRNA) • Animaux: bloc traduction (mismatch) Végétaux: clivage (match) • Gènes régulateurs cibles Facteurs de transcription (morphologie foliaire, florale) Cytochrome c oxydase, ATP sulfurylases, protéines du spliceosome • Cibles conservées entre le riz et Arabidopsis

Répression Génique Induite par les ARN Un Bilan Régulation de l’expression des gènes (miRNA) • Validation d’une cible de miRNA miR165R miR166R Revoluta

Répression Génique Induite par les ARN Répression d’un transgène GFP Un Bilan Système de défense contre les virus (siRNA) • Déclenchement local – Dissémination dans toute la plante (effet systémique) • Greffe: Répression s’étend au greffon • Signal inconnu mais une composante ARN siRNA dans la sève élaborée, dans le greffon • Défense contre les virus: Course contre la montre, de cellule à cellule, jusqu’aux faisceaux vasculaires Répression d’un transgène GFP

Répression Génique Induite par les ARN Un Bilan • Vu comme une Gêne pour les généticiens moléculaires des plantes (Expression Limitée des Transgènes) • Outil puissant de Contrôle de l’expression des gènes • Enjeu Biotechnologique Thérapie Génique chez les animaux "Molecular Farming" chez les plantes

Répression Génique Induite par les ARN Biotechnologie Végétale Hairpin RNA interference: hpRNAi • Développée par le CSIRO (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization) • Construction unique associant une séquence sens et antisens, et générant en se repliant une Structure Tige-Boucle • Déclencheur le plus puissant du RNAi

Biotechnologie Végétale hpRNAi pHANNIBAL Gène Cible PCR XhoI EcoRI XbaI HindIII Digestion – Ligation Not I EcoRI XhoI HindIII XbaI CaMV 35S intron PDK OCS terminateur Clonage Not I Not I CaMV 35S sens intron PDK antisens OCS terminateur Vecteur Binaire

Biotechnologie Végétale hpRNAi Plus efficaces que les ARN antisens Neutralisation d’un gène de floraison chez Arabidopsis

Biotechnologie Végétale hpRNAi Efficacité dans l’induction du RNAi Immunité face au PVY (Potato Virus Y) % de plantes immunes

Biotechnologie Végétale hpRNAi dans différentes plante Pomme de terre • Résistance au PLRV (Potato Leaf Roll Virus) • Réduction du brunissement par répression de la polyphenol oxydase

Biotechnologie Végétale hpRNAi Orge et Blé • Résistance au BYDV (Barley Yellow Dwarf Virus). • Millions de dollars de perte chaque année • Immunité en serre et en champ – sans symptôme – pas de réplication du virus dans plantes infectées. • Une construction hpRNAi ciblant le BYDV et le CYDV (Cereal Yellow Dwarf Virus) est en cours d’utilisation pour transformer le blé et l’orge.

Biotechnologie Végétale hpRNAi Coton • Margarines et huiles de cuisson dans la restauration collective. • Le traitement de l’huile augmente les quantités d’acides gras polyinsaturés. • Inactivation du gène FAD2-1 (ac. oléique transformé en acide gras polyinsaturé) • Enrichissement de la graine en Acide Oléïque et Diminution des Acides Gras Polyinsaturés. L’huile est propre à la consommation.

Biotechnologie Végétale hpRNAi Tests dans différentes plantes

Biotechnologie Végétale hpRNAi Delphinidin gene DFR: Dihydro flavonol reductase

Biotechnologie Végétale amiRNA • Articicial microRNA: ARN simple brin de 21N n’existant pas à l’état naturel mais produits à la suite de la modification d’un gène codant un miRNA naturel réintroduit dans le génome hôte par transgenèse. pre miR164 amiRNA • Transcription placée sous le contrôle d’un promoteur spécifique (35S, du gène à neutraliser…)

Biotechnologie Végétale amiRNA Propriétés de la cible 5’ 3’ amiRNA cible 3’ 5’

Biotechnologie Végétale amiRNA Propriétés du amiRNA - un U au début - extrémité 5’ plus instable que celle du amiRNA* un A ou un U en position 10 Possibilité de neutraliser plus d’une cible

Biotechnologie Végétale amiRNA Design du amiRNA http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl?page=3

Biotechnologie Végétale amiRNA

Biotechnologie Végétale amiRNA amiRNA versus hpRNAi hpRNAi: Fragments de 100-800bp utilisés Nombreux siRNA différents produits Prédiction des cibles difficiles (paramètres de choix pas connus) amiRNA: efficacité réelle ?