2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (2) Patterson isomorphe et (3) Patterson anomale Voir partie (3) et partie (4) (4) Section de Harker Important pour les Patterson isomorphe et anomale Les éléments de symétrie de la maille cristalline peuvent engendrer des pics dans certains plans ou sections particulières Section de Harker Les coordonnées des vecteurs interatomiques entre 2 mêmes atomes reliés par la symétrie du cristal peuvent présenter des particularités

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker Exemple : groupe d’espace P21 (2 positions équivalentes) Matrice d’interaction : Déterminer les coordonnées des vecteurs interatomiques entre atomes reliés par symétrie (chaque atome existe en position 1 et 2) x y z -x y+1/2 -z 0 0 0 -2x +1/2 -2z 2x -1/2 2z Les vecteurs interatomiques entre positions symétriques présentent des coordonnées uvw particulières : ±2x ±1/2 ±2z

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker Les pics correspondants appartiennent tous à un plan v = 1/2 = SECTION DE HARKER maille w 2x 1/2 2z v -2x 1/2 -2z 2 pics u Carte des vecteurs interatomiques en v = +1/2 P(u,1/2,w) 1 atome

2. La fonction de Patterson 2.3. Applications de la fonction de Patterson (4) Section de Harker La section de Harker dépend du groupe d’espace - pas de symétrie : pas de section de Harker - axe de rotation selon b: section de Harker en v = 0 - axe de rotation selon c : section de Harker en w = 0 - axe hélicoïdal 21 selon b : section de Harker en v = 1/2 - axe hélicoïdal 31 selon c : section de Harker en w = 1/3 - axe hélicoïdal 41 selon c : section de Harker en w = 1/4 - etc …

3. LA DIFFUSION ANOMALE

Solution du problème de phase Remplacement moléculaire Modèles similaires MR Méthodes directes temps de calculs; très haute résolution Remplacement isomorphe Addition d’atomes lourds Résidus réactifs; variations de l’intensité MIR Diffusion anomale à longueur d ’ondes multiples MAD L’effet anomale varie l’intensité; dépendence de la longueur d’onde X

Nouvelle structure versus nouveau repliement La « Protein Data Bank » 8867 8290 2234 Year 87 244 486 11 395 remplacement moléculaire

Phasage La cryo-cristallographie et l’augmentation de l’accès à des lignes de lumières adaptées, mène de plus en plus vers la resolution des structures par la méthode MAD.

FP = F a =  f ei =  r(x,y,z) ei2(hx+ky+lz) Rappel : imaginaire FP F a a ? a réel FP = F a =  f ei =  r(x,y,z) ei2(hx+ky+lz)

Construction de Harker ou Diagramme de Argand

3. La diffusion anomale 3.1. Absorption des rayons X Le phénomène d’absorption Définition Diminution de l’intensité du rayonnement X lorsqu’une matière est traversée. Cette diminution suit une loi de décroissance exponentielle en fonction de la longueur traversée. I0 Exemples de l1/2 Air 4,1 m Aluminium 0,5 mm Plomb 4 µm I0/2 l l1//2 Applications Protection contre le rayonnement Ecrans absorbants de protection en plomb l = Longueur traversée

3. La diffusion anomale 3.1. Absorption des rayons X Variation du coefficient d’absorption L’absorption se mesure en fait par le coefficient d’absorption massique (µ/ρ), caractéristique de chaque élément chimique Il varie avec le numéro atomique Z et la longueur d’onde Variation de µ/ρ en fonction de la longueur d’onde variation brutale au niveau des longueurs d’ondes d’émission correspondant à l’énergie nécessaire pour extraire des électrons d‘une couche donnée Ces discontinuités correspondant aux énergies d'extraction des électrons des couches K, L1, L2, etc…

Principe de la méthode MAD Les différents seuils d ’absorption 2p L 3d M 1s K Les différents seuils d ’absorption correspondent aux différentes couches électroniques excitées Absorption au seuil fort/mesurable (ligne blanche) surtout pour les éléments à électrons de la couche d et f

3. La diffusion anomale 3.1. Absorption des rayons X Application de l’absorption des rayons X Résolution de structures de macromolécules en cristallographie biologique Donc lorsque incident  seuil : Le phénomène d’absorption n’est plus négligeable Pour incident  1 Å, seuls les atomes lourds présentent une absorption non négligeable DIFFUSION ANOMALE Seuil d’absorption

3. La diffusion anomale 3.2. Le facteur de diffusion atomique Dans l’expression du facteur de diffusion fj, on néglige l’attraction du noyau sur les électrons (on les considère libres) Un calcul plus rigoureux impose une correction par rapport à la diffusion d’un électron libre Modèle de l’électron libre Modèle réel : Diffusion anomale absorption Le facteur de diffusion atomique est complexe fj = facteur de diffusion de l’atome j fj = f° f0 fj = facteur de diffusion de l’atome j fj = f° + f’ + i f" f" f’ f0 f’ : terme dispersif f" : terme d’absorption

3. La diffusion anomale 3.2. Le facteur de diffusion atomique Dès que f’ et f’’ ne sont plus négligeables = diffusion anomale C’est le cas lorsque incident  seuil Pour incident  1 Å, seuls les atomes lourds présentent une absorption non négligeable Variation en fonction de la résolution λ (Å) 34 fo Se f" E (eV) 6 résolution A haute résolution la diffusion anomale est plus importante fo diminue f’ et f" quasi-constants

Tableau des éléments pour les seuils d’absorption element: Fe Edge keV Å K 7.1120 1.7433 scattering factors data file Fe.dat element: Mg Edge keV Å K 1.3050 9.5007 scattering factors data file Mg.dat element: S Edge keV Å K 2.4720 5.0155 scattering factors data file S.dat element: Hg Edge keV Å K 83.1023 0.1492 L-I 14.8393 0.8355 L-II14.2087 0.8726 L-III12.2839 1.0093 M1 1.0721 11.5646 scattering factors data file Hg.dat http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html element: Ca Edge keV Å K 4.0381 3.0704 scattering factors data file Ca.dat element: Se Edge keV Å K 12.6578 0.9795 L-I 1.6539 7.4965 L-II 1.4762 8.3989 L-III1.4358 2.7207 scattering factors data file I.dat element: I Edge keV Å K 33.1694 0.3738 L-I 5.1881 2.3898 L-II 4.8521 2.5553 L-III 4.5571 2.7207 M1 1.0721 11.5646 scattering factors data file I.dat element: Yb Edge keV Å K 61.3323 0.2022 L-I 10.4864 1.1823 L-II 9.9782 1.2426 L-III 8.9436 1.3863 M1 2.3981 5.1701 M2 2.1730 5.7057 scattering factors data file Yb.dat

Phasage par MAD l1Fph+hkl h k l l1 point d ’inflection l3Fph+hkl h k l lointaine l2Fph+hkl h k l l2 seuil -h -k -l D disp D ano l1Fph-hkl l2Fph-hkl l3Fph-hkl  Fph+hkl Fph--h-k-l Violation de la loi de Friedel µ f `` f ` energy

3. La diffusion anomale 3.3. Conséquence de la diffusion anomale Pour les atomes lourds fa = f°a + f’a + i f"a On pose fa = f°a + f’a Im F F’’a F = foP e iP + (fa + if"a) e ia F = fP e iP + fa e ia + if"a e ia F = Fp + Fa + iF"a FPH F Fa FP Re F -FP -F -Fa a + ib Fp Fa i(a - ib) i(a + ib) F"a -F’’a a - ib

3. La diffusion anomale 3.3. Conséquence de la diffusion anomale FPH F Im F F’’a FPH F Fa Im F F’’a -F’’a FPH FP Re F F Fa -F -FP FP Re F -F -Fa -F’’a La loi de Friedel n’est plus respectée

√Nano √Nano Quand est-ce que la méthode MAD est faisable? Estimation de la « force » du signal anomal/dispersive Différence dispersive maximale : |f’li – f’lj|max Différence anomale maximale : 2f’’max En fractions de <|Fp|> = √∑f02 Approximation pour <|Fp|> ≈ 6.7 √(nombre d’atomes) ou √(3.14 x poids moléculaire) Donc : √Nano 2 |f’li – f’lj|max <|Fp|> x signale différence dispersive √Nano 2 2f’’max <|Fp|> x signale différence anomal

3. La diffusion anomale 3.4. Principe de la méthode Fano = Fhkl  F-h –k -l Il est basé sur la modification de la diffraction lorsqu’un ou plusieurs diffuseurs anomaux sont présents dans le cristal, cad sur la différence d’intensité d’une paire de Bijvoet On définit la fonction de Patterson suivante P(uvw) =  (Fano )2 cos (2(hu + kv + lw)) avec ΔFano = Σ ΔF’’ Fonction de Patterson définissant une carte dont les pics sont les vecteurs interatomiques entre diffuseurs anomaux uniquement =

3. La diffusion anomale 3.4. Principe de la méthode Les diffuseurs anomaux sont localisés dans la section de Harker La déconvolution de la fonction de Patterson ou les méthodes directes permet de déterminer les positions des diffuseurs anomaux 1 Cartes de Patterson (unité asymétrique) de différence anomale expérimentale Groupe d’espace P21 u 1/2 w fA xA,yA,zA FAcalc, φAcalc TF

3. La diffusion anomale 3.5. Méthodologie Introduction de diffuseurs anomaux dans le cristal ou directement dans la protéine Atomes lourds Développements de cette technique : utilisation de la sélénométhionine méthionine sélénométhionine C C 34 e- S 16 e- Protéine Native Protéine Séléniée

3. La diffusion anomale Phasage MAD l3Fph+hkl 3.5. Méthodologie Introduire un diffuseur anomal Aller au synchrotron sur une ligne adapté au MAD Mesurer le seuil d’absorption (sur un premier cristal) Collecter trois différents longueurs d’onde Connaître le groupe d’espace Mise à l’échelle entre DIFFERENTS longueur d’ondes avec SCALA (CCP4) Déterminer les sites du diffuseur anomal (PATTERSON anomal ; dispersive) Mettre les sites et les données dans un programme de phasage

3. La diffusion anomale (1) SAD : Single Anomalous Dispersion 3.5. Méthodologie (1) SAD : Single Anomalous Dispersion Collecte d’un jeu de données à 1 longueur d’onde : on se place à la longueur d’onde pour laquelle f" est maximal Pb : ambiguïté sur les phases (voir 3.6), méthode efficace uniquement pour des données de bonnes qualités (2) MAD : Multiple Anomalous Dispersion Collecte de 3 jeux de données à 3 longueurs d’onde 1. f" maximal 2. f’ maximal 3. loin du seuil d’absorption (pas d’effet anomal)

3. La diffusion anomale FP ? tels que 3.6. Détermination des phases Im F F’’a -F’’a FPH FP ? tels que F Fa -F FP Re F F+ = Fp + Fa + iF"a F- = Fp + Fa - iF"a modules de F+ modules de F- modules et phases de Fa modules et phases de F"a On dispose de : Construction de Harker

3. La diffusion anomale 3.6. Détermination des phases H K FPL(-) axe imaginaire H FPL(+) K F"L -F"L axe réel FPL(-) -F’L O Pour chaque réflexion hkl Construction de Harker

3. La diffusion anomale 3.6. Détermination des phases H K FPL(-) axe imaginaire H A partir de la position des diffuseurs anomaux, on peut déterminer φP pour chacune des réflexions FP, φP xP,yP,zP TF-1 FPL(+) K F"L -F"L FPL(-) -F’L O

Stratégies de collectes selon le groupe d’espace 1 2/m mmm (Laue class) sym sym h k l → -h –k -l h k l → -h k –l → h –k l h k l → -h -k l → h k -l paires de Friedel tous les 180° Collecte 360° paires de Friedel sur même image Collecte 180° Collecte 90° P31 P3121 P62 3 3m 6/m sym sym sym h k l → k-h -h l → h-k h -l h k l → k h l → -k -h l h k l → -h -k l → h k -l paires de Friedel tous les 60° Collecte 2x60° paires de Friedel tous les 30° Collecte 2x30° paires de Friedel sur même image Collecte 60°

Avantages – Inconvénients de la méthode MAD l1Fph-hkl l2Fph-hkl l3Fph-hkl l3Fph+hkl l1Fph+hkl Avantages – Inconvénients de la méthode MAD Avantages : Idéale si protéine contient diffuseur anomal Si protéine recombinante – production Se-met Un marquage suffit avec plusieurs l Inconvénients : Besoin du synchrotron pour varier l Les cristaux ne tiennent pas toujours pour la collecte complet

Le traitement des erreurs |FPH| |FH| |FP| Pj(a) 0 a D 2π Hendrickson-Lattman coefficients (A,B,C,D)

Distribution de la probabilité de la phase Le traitement des erreurs distribution gaussienne Q =  w (|Fo|–|Fc|)2 Moindre carrées: Supposition que la distribution des erreurs et gaussienne. Faux, quand les erreurs sont large. Distribution de la probabilité de la phase intégration de la vraisemblance de la réponse distribution de ‘Rice’ Maximum Likelihood: - meilleur estimation de la probabilité - incorporation de toutes sort d’information (erreurs, données absents, i.e. free)

Quand choisir quelle méthode de phasage ? RM quand on a un modèle homologue (~>30%) a essayer presque en tous les cas, même si inférieur MAD quand on produit la protéine de façon recombinante – production de la protéine séléno-méthioné MAD quand la protéine contient de façon naturel des bons diffuseurs anomal (Fe, Zn, Cu) ou des atomes facilement échangeable (Ca, Mg, Mo) SAD quand le cristal ne tient pas pour 3 longueurs d’ondes au complet SIRAS quand on réussit d’obtenir un bon dérivé avec un atome qui est bon diffuseur anomal MIRAS, MIR quand tous le reste ne marche pas

Acta Cryst D Vol 59 (11) CCP4 study weekend 2003 Liste des ‘solutions miracles’ (avec connotation « historique ») MIR – marquage avec atomes lourds MAD – un seul dérivé (ou diffuseur naturel) avec synchrotron SIR, SIRAS - ‘Maximum Likelyhood’ Se-MAD introduction d’une sonde ‘systématique’ par biologie moléculaire SAD Xénon Iode (I3), complexe au Gadolinium Sulfur (and Ca2+) SAD Triangle ‘magique’ (3 I) M.Perutz 1956, Kendrew 1958 Wayne Hendrickson 1988,91 G.Bricogne, de la Fortelle 1997 W.Hendrickson 1995-1997 R.Read, Z.Dauter 1999-2002 M.Schiltz, G.Bricogne 1997 Evans,Bricogne 02 et R.Kahn 03 Yang 2003 Beck, G.Sheldrick 2008 Acta Cryst D Vol 59 (11) CCP4 study weekend 2003

Les différents programmes de phasage MIR et MAD, (MIRAS, SAD, SIRAS….) et méthodes directes Crank; DM; arp-warp - CCP4i Solve ; Resolve - Phenix SHARP; Solomon - autoSHARP Phases ; (XtalView) CNS - CNS SnB (Shake and Bake) Methodes directes SHELX c,d,e – hkl2map (………)

3. La diffusion anomale Avantages Un seul cristal est nécessaire 3.7. Conclusions Avantages Un seul cristal est nécessaire - pas de défaut d’isomorphisme La sélénométhionine, ou tout diffuseur anomal lié covalemment, est un point d’ancrage pour la construction de la structure - pas de problème d’occupation Phasage à haute résolution

3. La diffusion anomale Inconvénients 3.7. Conclusions Inconvénients Signal anomal faible par rapport aux intensités collectées - il faut 1 Me pour 8 kDa L’accès aux sources synchrotron est nécessaire - utilisation de Gd sur anode tournante

3. La diffusion anomale SIRAS, MIRAS Erreurs sur les phases 3.7. Conclusions Erreurs sur les phases Calcul des phases par distribution Gaussienne de probabilité de phase Combinaison des méthodes Remplacement isomorphe et diffusion anomale SIRAS, MIRAS Erreurs sur les phases Calcul des phases par distribution Gaussienne de probabilité de phase Combinaison des méthodes remplacement isomorphe et diffusion anomale SIRAS, MIRAS

4. LE REMPLACEMENT ISOMORPHE

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Il est basé sur le changement d’intensité causé par la présence d’un atome lourd dans la molécule (FH, H) Atome lourd cristal dérivé cristal natif « cristal différence » cristal virtuel FPH FP FH

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Hypothèse de base le cristal de la structure native et du dérivé lourd doivent être isomorphes : la symétrie cristallographique et les paramètres de maille sont conservés la molécule n’a subi ni rotation ni translation dans la maille pour pouvoir générer le « cristal différence »

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Pour chaque réflexion hkl Fhkl = P fP e 2i (hxP + kyP + lzP) + H fH e 2i (hxH + kyH + lzH) FP e i P FH e i H Atomes lourds Atomes légers FPH = FP + FH FPH = facteur de structure du cristal dérivé FH = facteur de structure des atomes lourds FP = facteur de structure de la protéine

4. Le remplacement isomorphe 4.1. Principe de la méthode Il faut disposer de plusieurs jeux de données : - jeu natif = cristal de protéine seule (FP) - un ou plusieurs dérivés lourds = cristaux de protéine + atomes lourds (FPH) Hypothèse de base Si les cristaux sont isomorphes, les FP sont les mêmes dans le cristal natif et dans les cristaux de dérivés lourds l FP = P fP e 2i (hxP + kyP + lzP) FPH = P fP e 2i (hxP + kyP + lzP) + H fH e 2i (hxH + kyH + lzH)

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie Préparation des cristaux de dérivés lourds Enregistrement espaces complets de diffraction de la structure native du (des) dérivé(s) lourd(s) Mise à l’échelle des jeux natif/dérivé(s) Détermination de la position des atomes lourds Affinement des paramètres des atomes lourds Calcul des phases (probabilité de phases) Calcul d’une carte de densité électronique

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie Obtention des dérivées lourds Classiquement obtenus par trempage des cristaux Les composés lourds diffusent dans le cristal à travers les canaux de solvant Ils peuvent se fixer sur des sites précis Ex : composés Hg réagissent avec les Cys accessibles et réduites à pH neutre Cette étape est souvent longue et fastidieuse Autre méthode possible : incorporation d’un atome lourd avant cristallisation Ex : Sélenométhionine cf diffusion anomale

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie Choix des atomes lourds Kit Hampton Research

4. Le remplacement isomorphe 4.2. Méthodologie L’incorporation de l’atome peut perturber l’empilement cristallin défaut d’isomorphisme Lorsque le défaut d’isomorphisme est important, les FP ne sont plus équivalents Le défaut d’isomorphisme augmente avec la résolution En général : Trouver la zone de résolution pour laquelle le cristal dérivé est isomorphe

4. Le remplacement isomorphe 4.3. Détermination de la position des atomes lourds a b Protéine native Atome lourd Protéine substituée (« isomorphe »)

4. Le remplacement isomorphe 4.3. Détermination de la position des atomes lourds FPH = FP + FH Fiso = FPH  FP On définit la fonction de Patterson suivante : P(uvw) =  (Fiso )2 cos (2(hu + kv + lw)) avec (Fiso )2 ~ |FH|2 Fonction de Patterson définissant une carte dont les pics sont les vecteurs interatomiques entre atomes lourds « uniquement » Calculée sur les données de diffraction issues de 2 cristaux (natif et dérivé) =

4. Le remplacement isomorphe 4.3. Détermination de la position des atomes lourds Les atomes lourds sont localisés dans la section de Harker La déconvolution de la fonction de Patterson permet d’avoir la position des atomes lourds Exemple : P21 2 pics dans la section de Harker v = 1/2 dus à 1 atome lourd 2x 1/2 2z -2x 1/2 -2z fH xH,yH,zH FHcalc, φHcalc TF

4. Le remplacement isomorphe 4.4. Détermination des phases FP ? tels que FPH = FP + FH Axe imaginaire H FP FH J -FH O Axe réel On dispose de : G module de FP module et phase de FH module de FPH FPH Construction de Harker

4. Le remplacement isomorphe 4.4. Détermination des phases FPH2 Axe imaginaire FP,φP H FP Avec un deuxième dérivé, on lève l’ambiguïté de phase FH -FH2 J -FH O Axe réel G FPH

4. Le remplacement isomorphe 4.4. Détermination des phases Pour chacune des réflexions on peut déterminer φP 2 méthodes SIR : « Single Isomorphous Replacement » 1 cristal natif + 1 seul cristal dérivé MIR : « Multiple Isomorphous Replacement » 1 cristal natif + Plusieurs cristaux dérivés (>2) Remarque : on peut combiner remplacement isomorphe et diffusion anomale (voir diapo suivante) FP, φP xP,yP,zP TF-1

4. Le remplacement isomorphe 4.5. Combinaison des 2 méthodes axe imaginaire Principe de la méthode SIRAS H FPH(+) FP K F"H -F"H axe réel FPH(-) -F’H O 1 cristal natif 1 cristal dérivé contenant des atomes lourds qui sont diffuseurs anomaux

4. Le remplacement isomorphe 4.6. Erreurs sur les phases Sources d’erreurs - coordonnées (x,y,z) des atomes lourds - amplitudes des F mesurés (FP et FPH) - défaut d’isomorphisme Erreur de fermeture : hypothèse : FPH + ε ε ε = |FPHobs| - |FPHcalc| ε = |FPHobs| - |[|FP|eiφP + |FH| eiφH] FPH FH FP Les erreurs sont traitées avec des méthodes statistiques L’erreur de fermeture est utilisée pour définir une probabilité de phase (voir document)

4. Le remplacement isomorphe 4.6. Erreurs sur les phases Hypothèse : les erreurs sont distribuées selon une Gaussienne P Cas du SIR φbest FP 70 330 Probabilité d’une phase de présenter une certaine valeur S’il y a n dérivés, les probabilités de phase des différents dérivés sont multipliées

4. Le remplacement isomorphe 4.6. Erreurs sur les phases La qualité de l’information sur chaque phase est mesurée par la figure de mérite (m ou fom) qui est le reflet de l’étroitesse de la distribution de probabilité : - m = 1 : distribution étroite - m = 0 : distribution plate φbest = 200 ° m = 0.23 φbest = 328 ° m = 0.95 Δφ = 76 ° Δφ = 18 ° 3 dérivés m = cos Δφ 330 centroïde de la distribution = phase la meilleure φbest Cartes de densités mhkl Fp e i αbest