La production d’embryons in vitro dans l’espèce bovine Prof. Ch. Hanzen Année 2014-2015 Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Service de Thériogenologie des animaux de production Courriel : Christian.hanzen@ulg.ac.be Site : http://www.therioruminant.ulg.ac.be/index.html Publications : http://orbi.ulg.ac.be/ Facebook : https://www.facebook.com/Theriogenologie

Objectifs Sous une forme chronologique, ce chapitre présente les différentes étapes entre la collecte d’ovocytes et l’obtention in vitro d’embryons transférables à savoir : la ponction transvaginale échoguidée (OPU) des ovocytes (Ovum Pick Up : OPU), l’évaluation de leur qualité, leur maturation et fécondation in vitro, la préparation des spermatozoïdes puis la culture des embryons obtenus. Le chapitre se conclut par une brève présentation des conséquences possibles de cette biotechnologie de l’embryon.

Objectifs spécifiques de connaissance Enoncer le matériel nécessaire à la réalisation de l'OPU Enoncer les critères de prélèvement des ovocytes d'une vache Enoncer les champs d'application potentiels de la méthode transvaginale énoncer de manière chronologique les différentes étapes conduisant au transfert de l’embryon obtenu in vitro. énumérer les divers aspects de la maturation ovocytaire énoncer les signes de la capacitation des spermatozoïdes et l'agent responsable de son induction in vitro énoncer les critères de fécondation définir la coculture et ses moyens de réalisation définir le LOS

Objectifs spécifiques de compréhension décrire la méthode dite OPU de prélèvement des ovocytes Comparer avantages et inconvénients de la FIV par rapport à la production in vivo d'embryons Ph. Geluck

Plan général Introduction générale Le prélèvement des ovocytes L ’évaluation de la qualité des ovocytes La maturation ovocytaire La fécondation in vitro La culture des embryons Autres manipulations

Introduction générale

In vitro In Vivo

Définitions Biotechnologies de l’embryon : Techniques mises au point à partir des connaissances de base acquises sur le développement de l'embryon. Trois générations à distinguer…et leur importance relative MOET : Multiple Ovulation and Embryo Transfer : 1 million de veaux nés OPU : Ovum Pick Up et FIV, MIV et CIV : 100.000 veaux nés Clonage : 500 veaux nés

Biotechnologies de l’embryon : génération 1 production d’embryons in utero après stimulation hormonale des femelles donneuses : superovulation mise au point du transfert d'embryons développement de la congélation Facteurs limitants : nombre faible d'embryons obtenus (7-8) et 5 à 6 transférables variabilité de production entre femelles traitées 20 à 30 % des femelles traitées ne donnent pas d'embryons transférables 25 % produisent plus de 6 embryons délai entre traitements de superovulation (60 j)

Biotechnologies de l’embryon : génération 2 Production d'embryons en co-culture, après maturation et fécondation in vitro d'ovocytes prélevés sur l'animal vivant ou après abattage FIVETE : Fécondation in vitro et transfert d’embryons OPU : Ovum Pick Up MIV : maturation in vitro (ovocyte) FIV : Fécondation in vitro (ovocyte) CIV : Coculture in vitro (embryon)

Biotechnologies de l’embryon : génération 3 Mise à profit des connaissances relatives aux premiers stades embryonnaires transfert nucléaire : production de clones transgenèse : introduction d’un gène étranger dans l'embryon sexage de l’embryon ICSI : Intra Cytoplasmic Spermatozoa Injection SUZI : Sub Zonal sperm Insertion

Chronologie 1951 Identification du phénomène de capacitation 1951 Premier transfert d’embryon dans l’espèce bovine 1959 Naissance du premier lapereau obtenu par FIV 1970 Premiers essais de fécondation in vitro chez la vache 1970 Première réussite de fécondation in vitro d'un ovocyte bovin 1973 Naissance du 1er veau après transfert d’un embryon congelé 1981 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte maturé in vivo 1986 Naissance du premier agneau obtenu par IVM/IVF 1986 Naissance du premier porcelet obtenu par IVF 1987 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte maturé in vitro 1988 Mise au point de l’OPU 1989 Naissance du premier porcelet obtenu par IVM/IVF 1990 Naissance du premier poulain obtenu par IVF 1992 Naissance du premier buffle obtenu par IVM/IVF 1993 Application de l’OPU en Belgique (Ulg) 1993 Naissance du premier chevreau obtenu par VM/IVF 1997 Naissance de Dolly 2000 Application en Belgique de l’OPU en ferme

Le prélèvement des ovocytes in vitro

Etapes du prélèvement in vitro Lavage préalable des ovaires prélevés dans du liquide physiologique à 39°C Aspiration dans un tube de 50 ml au moyen d ’une pompe à eau et d ’une aiguille (19G à biseau court) ou d ’une seringue Ponction de tous les follicules visibles de diamètre > 2-3 mm et d ’aspect transparent Décantation pendant 10 minutes Récupération des ovocytes Lavage dans milieu 199

Résultats (service d ’OGA) Années Type N ov NET % --------------------------------------------------------------------------------------------- 96-00 haute valeur génét 305 50 16 96-00 abattage nécessité 209 31 15 96-00 après engraissement 96 19 20 98-99 vaches réformées 6014 1582 26

Le prélèvement in vivo des ovocytes : OPU (Ovum Pick Up)

Sonde de ponction échoguidée 1207

Sonde de ponction échoguidée

Méthodes de l’OPU Evacuation des matières fécales et de l’urine Désinfection région vulvaire Introduction du guide aiguille dans le vagin Positionnement transrectal de l’ovaire sur la sonde Identification du follicule Ponction et aspiration (mouvements circulaires) Une même aiguille pour les deux ovaires Temps total : 10 à 15 minutes

La ponction en direct

Etapes de la FIVETE Prélèvement des ovocytes par ponction Recherche des ovocytes Identification de la qualité des ovocytes Maturation des ovocytes pendant 24h Fécondation des ovocytes : 18 heures Co-culture sur cellules d’oviductes des embryons Transfert au jour 7 Gestation Parturition 2ème doc 2003-2004 Ch. Hanzen FMV Chapitre 24 L'insémination artificielle

Résultats moyens de l’OPU (service d’OGA) OR : ovocytes récupérés : 60 % (/ N follicules) OMM : ovocytes mis en maturation : 80 % (/ OR) OM : ovocytes maturés : 50 % (/ OMM) MO/BL : N embryons obtenus 30 % (/ OM)

Résultats moyens de l’OPU par session de ponction

Effet d’une stimulation ovarienne La stimulation n’est pas indispensable mais il est vrai que : Le traitement multiplie par 2.4 le nombre de follicules ponctionnables (11 à 17 vs 5 à 7) Le traitement de stimulation triple le nombre d ’ovocyte (8 à 12 vs 3 à 4) et le nombre d ’embryons obtenus par ponction Le traitement de stimulation augmente le % de récupération (70 % vs 52 %)

Conséquences de l’OPU A court terme à moyen terme (5 mois de ponction) Ponction hebdomadaire : pas d’effet sur le cycle Ponction bihebdomadaire : état d’anoestrus recrutement d’une population plus homogène Pas de lutéinisation du follicule ponctionné Pas de modification du moment d’apparition du pic de LH (après PGF) à moyen terme (5 mois de ponction) pas d’effet sur la cyclicité Gestation toujours possible Léger épaississement de la capsule ovarienne Très rarement : hématome folliculaire (>10 mm

OPU : autres champs d’application potentiels Animaux prépubères laparoscopie : veaux de 3 à 9 semaines échographie : veaux de 6 à 16 semaines ou de 6 à 9 mois Avantage : raccourcissement de l’intervalle entre générations A réserver aux animaux > 6 mois (problème de maturation ovocytaire) Animaux gestants : pas d’interférence avec l’intervalle de vêlage pas de risque d’avortement à réserver aux 3 premiers mois : accès aux ovaires

OPU : autres champs d’application potentiels Applications cliniques prélèvements répétés de liquides allantoïdien ou amniotique (> J30) : sexage ? Suppression de l’effet négatif du follicule dominant (infertiles) Synchronisation de l’ovulation si ponction des follicules > 5 mm 4 jours avant l ’injection d ’une PGF Production d’animaux transgéniques : meilleur contrôle du statut sanitaire et génétique des animaux prélevés in vivo Application à d’autres espèces animales : jument (cfr S Deleuze), chèvre

Avantages de l’OPU Augmentation du nombre d ’embryons produits par unité de temps / superovulation Réduction de la consanguinité par l ’utilisation de taureaux différents lors de chaque séance de FIV (Rem : 1.8 taureau en moyenne utilisé pour 3.4 ponctions) Reproduction des animaux qui ne répondent plus à la superovulation Prélèvement des donneuses sans interférence avec l ’intervalle entre vêlages Réalisation possible en ferme

L ’évaluation de la qualité des ovocytes du COC (Cumulus Oocyte Complex)

Evaluation de la qualité : 4 classes COC et cumulus idem Ooplasme plus irrégulier Classe 1 Aspect transparent du COC Cumulus compact Ooplasme homogène Classe 4 Cumulus expansé voire absent (naked oocytes) Classe 3 cumulus moins compact ooplasme sombre et plus irrégulier

La maturation des ovocytes

Rappels Naissance : blocage des ovocytes en prophase 1 Maturation ovocytaire = reprise du développement Finalité de la maturation reconnaissance et pénétration par le spz assurer les premiers stades du développement de l ’embryon Population concernée : 1 % des ovocytes

Les trois types de maturation maturation membranaire reconnaissance de la ZP3 par le spz fixation du spz par la ZP2 stabilisation de la pellucide par ZP1 maturation cytoplasmique Migration des granules vers la périphérie synthèse de l ’ovoperoxydase pour empêcher polypsermie protéosynthèses maturation nucléaire : perte de la membrane nucléaire (GVMB : Germinal Vesicule Membrane Breakdown) émission du 1er globule polaire

Principes généraux Mise en maturation dans des micropuits (une vingtaine d ’ovocytes par 50 à 100 microlitres) renfermant un milieu Température de 39°C Durée de la maturation : vache : 18 à 24 heures Critères de maturation expulsion le plus souvent du 1er globule polaire dispersion des cellules du cumulus (COC expansé) sous l ’effet de l ’acide hyaluronique induit par la LH développement d ’un blastocyste

Ovocyte et cellules folliculaires (= COC) Ovocytes avec globule polaire expulsé

GP Ovocyte maturé Espace périvitellin Goutelettes lipidiques

La maturation en direct (avec l’aimable autorisation de l’UCL)

La fécondation in vitro proprement dite

Milieux Lavage des ovocytes prélevés : M199 Maturation des ovocytes : M199 + LH + FSH Milieu de lavage en postmaturation : HTL cad Tampon Hepes et TALP cad milieu de Tyrode modifié par addition d ’Albumine, Lactate et Pyruvate Milieu de préparation des spermatozoïdes : SPTL cad Sperm TALP Milieu de fécondation : IVFTL (In Vitro Fécondation TALP) Remarque : toujours addition d ’Ab

Migration des spermatozoïdes Migration passive et active Zones de stockage et de relarguage Perte de protéines de surface présentes dans l ’épididyme et le plasma séminal et de la spermine un agent de décapacitation Réduction du nombre Capacitation

Etapes de la fécondation

La sélection des spermatozoïdes Décongélation d ’une paillette Séparation des spz du milieu séminal et des agents cryoprotecteurs par lavage dans un milieu ou par passage sur un double de gradient de percoll ou par swim-up Remise en suspension pour enlever le glycérol Détermination de la concentration Ajustement de la concentration à 2.000.000 /ml

L’induction de la capacitation Incubation pendant 15 minutes de la solution de spz avec de l ’héparine Capacitation = Processus qui rend le spz apte à assurer la fécondation Durée (vache) de 4 à 6 heures Faits Augmentation de la mobilité Déclenchement de la réaction acrosomique

La fécondation proprement dite goutte de 50 à 100 microl de milieu sous paraffine (pour éviter l ’évaporation) / goutte : 10 ovocytes et 100.000 spermatozoïdes (2 millions / ml) incubation de 18 heures à 39°C à 5% de CO2 et atmosphère saturée en humidité

Critères de fécondation apparition des deux globules polaires ou de deux pronoyaux (visualisation chez la vache après centrifugation ou coloration à la fuschine : différence avec la souris ou la femme) Identification de spermatozoïdes accessoires sur la pellucide Taux de clivage : nombre de blastomères identifiés à 48 heures 4 : 13 % de développement blastocytaire > 4 : 40 % de développement blastocytaire

Ovocytes (COC) en fécondation Ovocytes et expulsion des deux globules polaires

La fécondation en direct …

La culture des embryons

Indication et méthodes Impératif levée du blocage de développement observé in vitro avec les embryons animaux (différence avec l ’espèce humaine) Stade du blocage variable souris : 2 cellules porc : 4 cellules bovin : 4 - 8 cellules brebis : 8 - 16 cellules Méthodes : in vivo ou in vitro

La culture in vivo des embryons Oviductes de lapine ou de brebis (intérêt surtout historique) transfert de plusieurs dizaines (20 à 50) d ’embryons par oviducte (ligaturé) 1 à 2 jours après l ’ovulation de brebis synchronisées A J7 récupération de 57 % des embryons Stade morula - blasto : 24 % Cultures de cellules trophoblastiques tubaires, granuleuse ou somatiques (foie, rein) Milieux définis renfermant les secrétions des cellules tubaires SOF : Synthetic oviductal fluid CR1 = milieu de Rosenkrans BMOC-3 milieu de Brinster

Morula en coculture de cellules d ’oviducte

Le développement des embryons en direct (avec l’aimable autorisation de l’UCL)

Conséquences de la FIVETE

Embryons in vitro et in vivo

Caractéristiques comparées des gestations obtenues par IA et par FIV IA FIV (n = 2787) (n = 944) -------------------------------------------------------------------------------- Poids naissance mâle 44 48 femelle 41 47 Durée de gestation 281 284 Mortalité périnatale (%) 6.2 8.6 % de veaux mâles 49 55 % de malformations 0.7 3.2 (30 cas) ------------------------------------------------------------------------------------ Résultats: Holland genetics (De Ruigh L. AI Vets Bruges 1998)

Nature des anomalies observées après FIV 3.2 % sur 944 gestations (30 cas) --------------------------------------------------------------------------- N % Hydropisie des membranes fœtales 17 57 Anomalies des membres 8 27 Veau bull-dog 1 3 Autres 4 13 Résultats: Holland genetics (De Ruigh L. AI Vets Bruges oct.1998)