Purification et caractérisation des protéines CHMI 2227F Biochimie I Purification et caractérisation des protéines CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines Procédure générale Homogénéisation Extrait protéique brut Étapes de purification grossières Chromatographie 1, 2, 3….x étapes PURE! (bon, bin, j’espère…) Détection de la présence de la protéine d’intérêt: Activité Pureté Quantité CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines 1. Méthodes grossières CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Précipitation différentielle 1.1. Précipitation par modification du pH solubilité pI CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Précipitation différentielle 1.2 «Salting out » http://www.tulane.edu/~biochem/med/pure.htm CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Précipitation différentielle 1.2.Salting out Mélange de protéines dans un tampon: A: précipite à [ ] sel = 15% B: précipite à [ ] sel = 25 % C: précipite à [ ] sel = 35% Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 20% Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées Culot: protéine A Surnageant: protéines B + C Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 30% Culot: protéine B Surnageant: protéine C CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Centrifugation CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Dialyse Heures CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines 2. Méthodes fines Colonne Collecteur de fractions Réservoir de tampon Pompes Injecteur (échantillon) CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions Desorption Adsorption Anion exchanger NaCl Exemple de chromato. à échange de cations CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines 2.1. Chromatographie à échange d’ions Changement linéaire de concentration de NaCl Changement brusque de concentration de NaCl Ajoute tampon CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines 2.2. Tamisage moléculaire CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

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Purification des protéines 2.2. Tamisage moléculaire CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines 2.3. Chromatographie d’affinité CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Analyse des protéines Électrophorèse CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS www.biology.ucsd.edu/classes/bggn224.FA06/crash_2.ppt http://wine1.sb.fsu.edu/bch5425/lect20/lect20.htm CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 1. Électrophorèse PAGE-SDS Log Mr Distance migrée à partir du puits (cm) CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 2. Focalisation isoélectrique CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 2. Focalisation isoélectrique pH in gel = pI of proteins CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 3. Électrophorèse à deux dimensions CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 3. Électrophorèse à deux dimensions Chaque tache est une protéine CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 4. Analyse Western Structure d’un anticorps CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Électrophorèse 4. Analyse Western CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines Exemple et analyse des données CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines Exemple et analyse des données Gel de PAGE-SDS coloré au Bleu de Coomassie CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Purification des protéines Exemple et analyse des données CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Séquençage des protéines CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Séquence des protéines - anémie falciforme Globule rouge normal Globule rouge falciforme CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes Basé sur la propriété de réactifs chimiques/enzymes de couper le lien peptidique à un endroit très précis; Enzyme Acide aminé Site de coupure Trypsine Arg/Lys C-ter Chymotrypsine Phe/Trp/Tyr Protéase V8 Asp/Glu Pepsine N-ter Thermolysine Leu/Ile/Trp/Tyr/ Val/Ala/Phe Carboxypeptidase A Tous les a.a. en C-ter., sauf Pro, Arg/Lys - Libère l’acide aminé C-ter - Ne coupe pas si Pro est l’avant dernier acide aminé. Carboxypeptidase B Seulement Arg/Lys quant C-ter. Réactif Acide aminé Site de coupure Bromure de cyanogène Met C-ter b-mercaptoéthanol Cys Ponts disulfure Iodoacétate Prévient la réduction des ponts disulfure 1) 1-Fluoro-2,4 dinitrobenzène (FDNB) 2) Chlorure de dansyl 3) Chlorure de dabsyl Détruit tous les acides aminés sauf ceux en N-ter. Hydrazine Détruit tous les acides aminés sauf ceux en C-ter. NOTE: Trypsine, Chymotrypsine, protéase V8, pepsine et thermolysine ne COUPENT PAS si Pro fait partie du lien peptidique. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 1 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 2 Les données suivantes ont été obtenus après traitement d’un octopeptide: HCl 6M: Ala, Gly2, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr CNBr: 2 peptides sont obtenus: Peptide 1: Ala, Gly, Lys, Thr Peptide 2: Gly, Met, Ser, Tyr Trypsine: 2 peptides sont obtenus: Peptide 3: Ala, Gly Peptide 4: Gly, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr Chymotrypsine: 2 peptides sont obtenus: Peptide 5: Gly, Tyr Peptide 6: Ala, Gly, Lys, Met, Ser, Thr FDNB: donne Gly Carboxypeptidase A: donne Gly Quelle est la séquence de ce peptide? CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman Identification CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.