GENETIQUE BACTERIENNE Dr Christian CARRIERE Laboratoire de bactériologie Hôpital Arnaud de Villeneuve

A - Le chromosome bactérien ADN double brin « Gènes de la vie » Protéines structurales Protéines enzymatiques

Le chromosome bactérien

Le chromosome bactérien Applications pratiques 1 - Epidémiologie moléculaire “épidémiologie moléculaire” “épidémiologie conventionnelle”

Principe de l’épidémiologie moléculaire But : Comparer des isolats bactériens entre eux Même espèce bactérienne Coupure par 1 endonucléase Migration électrophorétique Profils de restriction Comparaison des profils = Technique d’électrophorèse en champ pulsé (ECP)

Variations observées sur les profils d’ECP Insertion (D) et perte (E) d’un fragment d’ADN sur le fragment de 400 kpb Gain (B) et perte (C) d’un site de restriction sur le fragment de 400 kpb Profil de référence A B C D E 500 kpb 400 kpb 200 kpb 50 kpb Nombre de différences par rapport au profil de référence 3 3 2 2

Interprétation de profils d’ECP Nombre de modifications génétiques par rapport à la souche épidémique Nombre de fragments différenciant la souche testée de la souche épidémique Interprétation microbiologique des profils Interprétation épidémiologique Semblables Souche faisant partie de l’épidémie 1 2 – 3 Très proches Souche faisant probablement partie de l’épidémie 2 4 – 6 Proches Souche faisant possiblement partie de l’épidémie 3 > ou = 7 Différents Souche non reliée à l’épidémie

M 1 2 3 4 5 6 kb 436,5 194 48,5

Epidémiologie moléculaire Isolats de Pseudomonas aeruginosa - 1 à 7 : 7 patients différents - 8 et 9 : fibroscope Isolats de Staphylocoques - service N° 1 (1 à 5) et - service N° 2 (6 à 9) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kb 436,5 194 48,5

Le chromosome bactérien Applications pratiques 2 - Identification : genre et espèce (taxonomie) ex : Escherichia coli Ancienne dénaturation ou fusion de l’ADN Tm : température de fusion G - C % Notion d’espèce - DTm et G-C % proches

Taxonomie bactérienne moderne => Espèces rares ou difficiles à identifier par méthodes commercialisées Séquençage Comparaison de séquences banques de séquences d ’ADN Nom de l ’espèce Culture PCR ADN r16S, 11

Analyse d’une séquence sur Internet 1-Aller sur un site spécifique 2- Copier la séquence à analyser 3- Envoyer la recherche

Identification d’une bactérie après séquençage Alignement des 2 séquences Pourcentage d’identité entre la séquence analysée et la séquence la plus proche de la banque de données Si le pourcentage est > à 97 % = même genre et espèce Si le pourcentage est < à 97 % = nouvelle espèce ou nouveau genre

Les plasmides Fragments d’ADN double brin Circulaires Intra cytoplasmiques Auto réplicatifs Portent des gènes de « survie » Adaptation à l’environnement Résistance aux antibiotiques +++

B – Les variations génotypiques Ce sont des modifications du génome bactérien essentiellement dues à des mutations Pour le clinicien, les applications : Virulence Résistance acquise aux antibiotiques

Les variations génotypiques Que se passe t-il au niveau génomique ? Microinsertions et microdélétions Mutations faux sens : erreur Mutations non sens : codon stop Mutations ponctuelles Idem ci-dessus Macroinsertions et macrodélétions Séquence de type IS (séquences d’insertion) Transposons Gain ou perte de gènes entiers (Résistance ATB)

La résistance a un support moléculaire (exemple des antituberculeux) Gènes mutés dans la résistance aux anti-tuberculeux (connus…) ISONIAZIDE katG, inhA, kasA, aphC RIFAMPICINE rpoB PYRAZINAMIDE pncA ETHAMBUTOL embCAB STREPTOMYCINE rpsL, rrs

Exemple : Mécanisme de résistance à la rifampicine Mode d’action : La rifampicine se fixe à la sous-unité  de l’ARN polymérase Empêche l'initiation de la transcription perturbe la synthèse des ARN messagers Mécanisme de résistance : 95% des souches portent des mutations ponctuelles dans le gène rpoB entre les codons 511 et 533 Diminution de l'affinité de l'ARN polymérase pour la rifampicine

Mutations dans le gène rpoB 511 533 rpoB 511 513 516 522 526 531 533 Leu Gln Asp Ser His Ser Leu Tyr Asp Leu Arg Pro Leu Pro Tyr Val Leu Leu Trp Pro

Propriétés des variations génotypiques 1 - Spontanéité le mutant résistant préexiste à l’utilisation de l’antibiotique qui le sélectionne ATB Bactéries sensibles Bactéries résistantes à l’antibiotique   ATB Population bactérienne Population bactérienne devenue résistante

Propriétés des variations génotypiques 2 - Rareté Taux de mutation = probabilité d’avoir un mutant résistant dans une population bactérienne ex : 10-5 Probabilité d’avoir 2 mutants résistants à 2 ATB = produit des probabilités de chaque mutation Application : Caverne pulmonaire=108 bacilles Rifampicine : Tx mut. = 10-7 Isoniazide : Tx mut. = 10-5 Mutant isoniazide et rifampicine « spontané » = 10-7 x 10-5 = 10-12

Propriétés des variations génotypiques 3 - Stabilité transmissible à la descendance 4 - Inductibilité U.V., mutagènes…

SUPPORT GENETIQUE DE LA RÉSISTANCE  Résistance naturelle : chromosomique  Résistance acquise : - chromosomiques, secondaires à une mutation - extra-chromosomiques par acquisition de gènes ex : plasmides

C - Transferts de matériel génétique Transformation Conjugaison Transduction

Caractéristiques communes à tous ces mécanismes de transfert Ces transferts d’ADN doivent être suivis de recombinaison génétique

I – La Transformation Transfert d’un fragment d’ADN en solution d’une bactérie donatrice à une bactérie réceptrice Ce modèle avait permis de démontrer que l’ADN était le support de l’hérédité en 1944 Expériences de Griffith

La transformation

DANGEREUX car les Pneumocoques deviennent à leur tour résistants Exemple : transformation des pneumocoques par de l’ADN provenant de Streptocoques ORL Les Streptocoques ORL Sont des commensaux de la gorge, salive… Peuvent porter des gènes de résistance aux antibiotiques Sont sélectionnés par l’antibiothérapie Transforment les Pneumocoques DANGEREUX car les Pneumocoques deviennent à leur tour résistants

II – Conjugaison Processus sexuel strict Contact et appariement Sexes différents, pili sexuels Pont cytoplasmique Transfert d’ADN chromosomique à sens unique, en général partiel

La conjugaison

La conjugaison : schéma

La conjugaison bactérienne Intéresse surtout les bactéries à Gram négatif N’importe quel gène peut être transféré : résistance, virulence … Principal facteur d’évolution bactérienne Intéresse aussi l’ADN plasmidique (plasmides conjugatifs)

Transfert de plasmides de résistance par conjugaison

III - La transduction Transfert de fragments d’ADN bactérien par l’intermédiaire de vecteurs : bactériophages ou « phages » Les bactériophages sont des virus infectant de façon spécifique les bactéries Se répliquent dans la bactérie Utilisent la « machinerie cellulaire » Peuvent lyser la bactérie

La transduction soit conversion lysogénique Expression du gène = prophage Soit cycle lytique Réplication du phage

Exemples de conversion lysogénique Production de toxines = virulence Corynebacterium diphteriae Toxine diphtérique : diphtérie Streptococcus pyogenes (groupe A) Toxine érythrogène : scarlatine

RESISTANCE BACTERIENNE NATURELLE ACQUISE Qq souches d’une espèce Tend à se répandre Chromosomique Fixe Constante 1 espèce bactérienne 1 ATB ou 1 famille Transm. Verticale Mutations Extra-Chromosomique Chromosomique Rare Stable Spontanée 1 ATB ou 1 famille Transm. Verticale Éléments Génétiques Mobiles (Plasm., Tn.) Fréquent Contagieux Plusieurs ATB = MultiR Transm. Horizontale