Séquençage par hybridation IFT 3290 – Bio-Informatique Winnie Sheun Yee Ng Hiver 2005

Des puces d’ADN Une puce contient un ensemble de sondes d’une taille fixe c’est-à-dire tous les k-mers. Une sonde est un fragment d’ADN sur la puce. http://keck.med.yale.edu/affymetrix/technology.htm

Détection par hybridation Construire une puce de toutes les sondes possibles de taille k. Incuber des fragments marqués de la séquence cible avec la puce d’ADN. Les fragments de la séquence cible s’hybrident avec les sondes dont les bases leur sont complémentaires.

Détection par hybridation Par spectroscopie, les sondes hybridées aux fragments cibles sont détectées. http://keck.med.yale.edu/affymetrix/technology.htm

Détection par hybridation La composition en k-mers de la séquence d’ADN recherchée est identifiée. Reconstruction de la séquence cible par des algorithmes combinatoires sur la composition en k-mers.

Séquençage par hybridation Problème : Reconstruire une « string » à partir de sa composition en k-mers. Entrée : Un ensemble, Spectrum, de tous les k-mers d’une « string » s inconnue. Sk(u) = {s[i, · · · , i+k − 1]: i = 1, · · · , |s| − k +1}. Sortie : Une « string » s reconstruite à partir du Spectrum(s, k).

Approche 1 : SBH, un problème de chemin hamiltonien Recherche d’un chemin hamiltonien dans un graphe de chevauchements où chaque k-mer de s (la séquence cible) est un sommet et où chaque chevauchement de taille (k-1) est un arc. Définition : Un chemin hamiltonien est un chemin dans G qui passe une et une seule fois par chaque sommet.

Reconstruction de séquence par l’approche du chemin hamiltonien Spectrum(s, k) = {ATG AGG TGC TCC GTC GGT GCA CAG} H N. C. Jones & P. A. Pevzner où les sommets = k-mers du Spectrum ; et les arcs = chevauchements entre les k-mers. Le chemin hamiltonien (chemin qui traverse tous les nœuds exactement une fois) correspond à la reconstruction de la séquence ATGCAGGTCC.

Reconstruction multiple de séquences par l’approche du chemin hamiltonien Spectrum(s, k) = {ATG TGG TGC GTG GGC GCA GCG CGT} H N. C. Jones & P. A. Pevzner Un tel Spectrum(s, k) résulte en deux chemins hamiltoniens distincts.

Reconstruction multiple de séquences par l’approche du chemin hamiltonien Spectrum(s, k) = {ATG TGG TGC GTG GGC GCA GCG CGT} H N. C. Jones & P. A. Pevzner ATGCGTGGCA

Reconstruction multiple de séquences par l’approche du chemin hamiltonien Spectrum(s, k) = {ATG TGG TGC GTG GGC GCA GCG CGT} H N. C. Jones & P. A. Pevzner ATGGCGTGCA

Complexité du problème du chemin hamiltonien Le problème du chemin hamiltonien est NP-complet c’est-à-dire que le temps de calcul nécessaire à sa résolution croît trop vite par rapport à la taille des données à traiter.

Approche 2 : SBH, un problème de chemin eulérien Recherche d’un chemin eulérien dans un graphe de chevauchements où tous les sommets sont toutes les sous-chaînes de longueur k-1 et où chaque k-mer de s est un arc entre son préfixe et son suffixe de taille (k-1).

SBH, un problème de chemin eulérien Définition : Un chemin eulérien est un chemin dans G qui visite chaque arc exactement une fois.

Reconstruction de séquence par l’approche du chemin eulérien Spectrum(s, l) = {ATG TGG TGC GTG GGC GCA GCG CGT} GT CG CA GC GG TG AT N. C. Jones & P. A. Pevzner où les sommets = (k-1)-mers ; et les arcs = k-mers du Spectrum.

Reconstruction de séquence par l’approche du chemin eulérien GT CG CA GC GG TG AT N. C. Jones & P. A. Pevzner Les chemins eulériens du graphe (chemin qui traverse tous les arcs exactement une fois) correspondent aux séquences.

Nombre de chemins eulériens Soit une matrice A = (aij), où aij = 1 s’il existe une arête allant du sommet I au sommet j dans le graphe eulérien G et aij = 0 sinon. Soit M la matrice –A et dont les éléments de la diagonale sont remplacés par degrein(i) pour tout i. où c(G) = cofacteur de M. G Chaque c(G) de M = 2. Le nombre de cycles eulériens dans G est 2 • 0! • 1! • 1! • 0! = 2

Complexité du problème du chemin eulérien La recherche du parcours eulérien se fait en temps linéaire avec un parcours en profondeur. En connaissant la multiplicité des arcs du graphe,

À noter L'assemblage par parcours eulérien est ambigu : il a beaucoup de chemins eulériens. Des méthodes biochimiques permettent de discriminer les hybridations non-spécifiques dans les expériences SBH.

Améliorer la puissance de résolution du SBH Le séquençage positionnel par hybridation est proposé. Le PSBH permet de mesurer approximativement la position de chaque k-mer du fragment d’ADN cible. PSBH se réduit à trouver un parcours eulérien avec la restriction additionnelle que la position de tout arc est dans l’intervalle de positions associé à cet arc.

Fin… Questions? Commentaires.

Annexe : Tailles… La longueur maximale d’un fragment d’ADN qui peut être reconstruite avec une tableau C(k) est estimée à √(2•4k). La longueur minimale de la sonde pour reconstruire une séquence de taille n à partir de son spectrum est estimée à .

Annexe : Manufacturer des puces d’ADN Une puce d’ADN est manufacturée par VLSIPS « very large scale immobilized polymer synthesis ». Les sondes sont développées un nucléotide à la fois à travers le processus photolithographique (série d’étapes chimiques). Chaque nucléotide a un « groupe protecteur  photolabile » qui empêche la croissance de la sonde.

Annexe : Manufacturer des puces d’ADN Ce groupement protecteur est désactivé par la lumière. À chaque étape chimique, une région prédéfinie du « array » est illuminée en activant ainsi la croissance nucléotidique. Tout le « array » est exposé à un nucléotide particulier mais les réactions d’ajout du nucléotide se produiront seulement sur les sondes de la région activée.

Annexe : Manufacturer des puces d’ADN En concaténant les nucléotides sur les sondes approppriées des régions approppriées, il est possible de développer un ensemble de sondes de taille k en moins 4•k étapes. Cependant, à cause de la diffraction, de la réflexion interne et de la dispersion, les points proches des limites des régions illuminées sont exposés à une illumination imprévue. Ainsi, des sondes de composition et de taille inconnues sont construites.

Annexe : Complexité du problème du chemin eulérien Si la multiplicité des arcs n’est pas connue, il s’agit alors du problème du facteur chinois où on recalcule, en temps polynomial, les multiplicités minimales qui permettent de parcourir le graphe.