Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale Hôpital Purpan Tél: 05 61 77 90 79 05 62 74 45 00

Structure générale d ’un gène chez l ’homme séquences amont promoteur codon d’initiation stop signal de polyadénylation TAA TGA TAG exons introns Enhancer Silencer Locus control region ATG AATAAA CAAT  TATA 5 ’ 3 ’ Gène Transcription clivage Unité de transcription Structure générale d ’un gène chez l ’homme

Expression d ’un gène chez l ’homme séquences amont promoteur codon d’initiation stop signal de polyadénylation TAA TGA TAG exons introns Enhancer Silencer Locus control region ATG AATAAA CAAT  TATA 5 ’ 3 ’ Gène Transcription clivage 5 ’ CAP AAAAAAAA 3 ’ ARNm immature Maturation épissage des introns 5 ’ 3 ’ ARNm mature AAAAAAAA Noyau Cytoplasme Protéine Traduction NH2 COOH

MUTATIONS Définition: Modification du matériel génétique (maladie/polymorphisme) Origines: - Spontanées: - Anomalies de la réplication de l ’ADN - les plus fréquentes (10-6 paires de bases par génération) - erreurs de l  ’ADN polymérase (misapariements) - favorisées par les séquences répétées - Accidents de recombinaison méiotique - surviennent lors de la méiose - favorisés par des séquences d ’homologie entre chromosomes - délétions, duplications, recombinaisons illégitimes

Origines des mutations (suite): - Spontanées: - Désamination d ’une cytosine méthylée - très fréquent en pathologie humaine - non reconnu par les systèmes de réparation de l ’ADN - ex: Arg CGA -> Stop TGA - Provoquées: - agents génotoxiques - 3 types: chimiques, physiques (radioactivité naturelle et autres rayonnements ionisants, UV…) ou biologiques (virus) - normalement corrigés au cours de la réplication par les systèmes de réparation de l ’ADN - déficients dans certaines maladies génétiques (ex: ataxie télangiectasie, xéroderma pigmentosum…)(cancers)

Types de mutations A - Mutations ponctuelles B - Insertion ou délétions de plusieurs bases C - Expansions de triplets (mutations instables) D - Macrolésions

A - Mutations ponctuelles Les plus fréquentes, extra ou intra-géniques, polymorphismes (RFLP, SNPs) ou mutations responsables de maladies génétiques 1 - Substitutions de base Définition: remplacement d ’un nucléotide par un autre Leur effet dépend de leur nature et position dans le gène: - régions codantes: - mutation silencieuse - mutation faux-sens - changement d ’un acide aminé par un autre - conservatrice (acide aminé de même classe) ou non conservatrice - mutation non-sens - changement d ’un acide aminé en un codon stop prématuré (TAA, TGA, TAG)

1 - Substitutions de base (suite) - régions codantes: cas particuliers: - codon d ’initiation de la traduction - codon de terminaison de la traduction - séquences « Exonic splicing enhancer  » (-> anomalie d ’épissage) - mutation non-sens entraînant le saut de l ’exon correspondant (-> rétablissement de la phase)

1 - Substitutions de base (suite) - régions non codantes: - introns: - sites consensus d ’épissage (site donneur gt, site accepteur ag) - sites non consensus d ’épissage - site de branchement - conséquences: -> saut d ’exon -> rétention d ’intron -> activation d ’un site cryptique d ’épissage, exonique ou intronique - séquences régulatrices en amont du gène -> anomalies de régulation de la transcription - séquences 3 ’UTR -> instabilité de l ’ARNm

gt ag gt ag gt c Saut d ’exon gt ag gt gt ag gt a Activation d ’un site cryptique d ’épissage gt ag gt ag gt stop Saut d ’exon Exemples anomalies d ’épissage

2 - Délétion ou insertion d ’une base - régions codantes: entraînent un décalage du cadre de lecture (« mutations décalantes ») conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice; anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage - région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

B - Insertion ou délétions de plusieurs bases (micro-délétions ou micro-insertions) Perte ou ajout de plusieurs bases - régions codantes: - Si multiple de 3: perte ou ajout d ’un ou plusieurs acides aminés - Si non multiple de 3 entraînent un décalage du cadre de lecture conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice: anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage - région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

Délétions génomiques de COL7A1 dans l’EBD dominante 6081del28 6847del27

Conséquences des mutations Mutation respectant le cadre de lecture: - ex: mutation faux-sens, insertion ou délétion multiple de 3, anomalie d ’épissage respectant ou rétablissant la phase - conduisent à la synthèse d ’une protéine anormale présentant: - le remplacement d ’un acide aminé par un autre - la perte ou le gain d ’un ou plusieurs acides aminés -> protéine produite, mais stabilité et/ou fonction compromises

Conséquences des mutations (suite) Mutation interrompant le cadre de lecture: - ex: mutations non-sens, insertion ou délétion non multiples de 3 - conduisent à un codon stop prématuré pouvant entraîner: - instabilité de l ’ARNm muté (NMRD) - synthèse d ’une protéine tronquée ayant une extrémité COOH anormale - synthèse d ’une protéine amputée d ’une séquence peptidique (saut d ’exon portant un PTC) -> protéine non produite, ou instable et/ou non fonctionnelle

C - Expansions de triplets (mutations instables) - Répétitions instables de triplets nucléotidiques - Nature, nombre, localisation (région codante/non codante) variables - Souvent maladies neuro-dégénératives - Le plus souvent transmission autosomique dominante - Exemples Syndrome de l ’X fragile CGG 5 ’UTR XR Xq27 Dystrophie myotonique de Steinert CTG 3 ’UTR AD 19q13 Chorée de Huntington CAG codante AD 4p16 Ataxie de Friedreich GAA intron 1 AR 9q13

D - Macrolésions - Conséquences délétères en pathologie et au cours de l ’évolution - Délétions de quelques centaines à plusieurs milliers de pb - Duplications - Fusion de gènes suite à une double cassure de l ’ADN (ex. translocation) - Inversions de gènes (orientation tête-bêche d ’un fragment d ’ADN)

Stratégies de recherche d ’anomalie des gènes (Maladie et gène connus +++) Analyse directe Mutation connue de petite taille de grande taille PCR - Enzyme de restriction - Hybridation spécifique d ’allèles - Séquençage +++ - Long PCR ou - Southern-blot

Identification d ’une mutation non sens de COL7A1 par séquençage Père Arg->Stop CGA -> TGA Mère Arg->Stop CGA -> TGA EB Tropho

Analyse directe Mutation inconnue PCR Détection: - SSCP Single strand conformational polymorphism - DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis - CSGE Conformation sensitive gel electrophoresis - DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography Identification: - Séquençage +++

Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC Pic d ’élution anormal Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)

Analyse directe Macrolésions Cytogénétique Biologie moléculaire - Hybridation sur chromosome (FISH, Fluorescent in situ hybridization) - Southern-blot - PCR: Perte d ’hétérozygotie Défaut d ’amplification de l ’ADN

Analyse indirecte Etude de marqueurs génétiques polymorphes: - intra-géniques ou flanquant le gène - microsatellites ou bi-alléliques RFLP: Restriction fragment length polymorphism SNPs: single nucleotide polymorphism)

Etude de liaison génétique utilisant les marqueurs de COL7A1 PvuII D3S1581 D3S1568 D3S1588 54,62 Télomère Mb D3S3582 43,88 45 D3S3629 46,47-48,91 3p21 48,985 49,48 50 A Centromère Chromosome 3 Marqueurs génétiques Distance physique

219 221 Père 227 237 Mère Génotypage de marqueurs de COL7A1 219 237 Enfant atteint d ’EB récessive

219 221 Père atteint 227 237 Mère Génotypage de marqueurs de COL7A1 219 237 Enfant atteint d’ EB dominante familiale

Diagnostic prénatal d ’EBDR par étude indirecte (marqueurs de COL7A1) Père Mère Enfant EBDR Enfant sain Trophoblaste Porteur sain

Diagnostic moléculaire des EB dystrophiques Sang Vérification des mutations ADN Génotypage (marqueurs de COL7A1) et Recherche de mutations de COL7A1 COL7A1 amplifié

Protéine qualitativement Exemples de conséquences des mutations Codons stop prématurés Mutations faux-sens Instabilité ARNm Protéine qualitativement anormale Protéine non produite Stabilité variable Fonction anormale (diminution, perte ou nouvelle fonction) Allèle nul (perte de fonction) Maladies récessives Maladies dominantes par haploinsuffisance Maladies dominantes (effet dominant négatif) Cancers

Nomenclature des mutations Mutations faux-sens: ex: E117K Mutations non-sens: ex: R542X Mutations d ’épissage: ex: 621 +1G ->A, 622 -2A->C Délétions, insertions: ex: F508del 6232-6236del ou 6232delATAAG 409-410insC ou 409insC

Merci