cinétique enzymatique -modèle de base de la cinétique enzymatique Michaelis –Menten -détermination des constantes cinétiques -Représentation hyperbolique (Michaelis-Menten ) -Représentation de Lineweaver-Burk -Inhibitions des réactions enzymatiques -Inhibition compétitive -IC50 pour inhibition compétitive -inhibition non compétitive -IC50 pour inhibition non compétitive -inhibition in compétitive -IC50 pour inhibition in compétitive - Graphiques de Dixon Pr M.SLIMANI

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E + S E + P ES Complexe enzyme-substrat à t=0, la concentration en substrat est désignée [S]0 la concentration en enzyme est désignée [E]T et reste constante tout au long de la mesure à t=0, la concentration du complexe enzyme-substrat, [ES], est égale à 0 à t=0, la concentration en produit est égale à 0 Pr M.SLIMANI

3 états lors de la cinétique Phases de la réaction 3 états lors de la cinétique état pré-stationnaire état stationnaire état post-stationnaire Pr M.SLIMANI

état pré-stationnaire état post-stationnaire Équation de Michaelis-Menten état pré-stationnaire état stationnaire état post-stationnaire E + S ES E + P [S] [P] [E]libre [ES] [S] Concentrations Vi [P] d[ES] dt =0 [ES] [E]libre Temps Pr M.SLIMANI

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k1 k2 k-1 E + S ES E + P Équation de Michaelis-Menten vi = k2 [ES] La vitesse d’apparition du produit P (vitesse de la réaction catalysée par l’enzyme) dépend de k2 et de la concentration en ES. vi = k2 [ES] La [ES] dépend de sa vitesse de formation et de sa vitesse de disparition. vformation ES = k1 [E] [S] vdisparition ES = k-1 [ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES] Pr M.SLIMANI

Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ]. ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E + P Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ] Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ] [ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"), donc vd = vf (k-1+ k2)·[ ES ] = k1·[ E ]·[ S ] [ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten) Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ]. [ E ] = [ E ]T - [ ES ] où [ E ]T est la concentration totale d'enzyme, libre ou lié. On a donc: Pr M.SLIMANI

[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM [ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM - [ ES ]·[ S ] / KM [ ES ] + [ ES ]·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM [ ES ]·( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T·[ S ] / KM [ ES ]·(KM + [ S ]) / KM = [ E ]T·[ S ] / KM [ ES ]·(KM + [ S ]) = [ E ]T·[ S ] [ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) On peut enfin introduire ce terme dans l'équation pour la vitesse initiale: vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ]) Pr M.SLIMANI

vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ]) L’équation de Michaelis-Menten vi = Vmax [S] KM + Vitesse initiale Pr M.SLIMANI

KM = [S] Constante de Michaelis-Menten KM KM [S] vi = Vmax + [S] ½ Vmax = Vmax [S] KM + Si vi = ½ Vmax ½ (KM + [S]) = [S] KM = [S] ½ KM = [S] - ½ [S] ½ KM = ½ [S] KM est la concentration en substrat pour laquelle l’enzyme fonctionne à la moitié de sa vitesse maximale KM est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme. Plus l’affinité est élevée, et moins il faudra de substrat pour que l’enzyme fonctionne. Pr M.SLIMANI

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KM KM KM KM KM vi = Vmax [S] + In vivo, la [S] est rarement saturante. Le rapport [S]/KM est compris entre 0,01 et 1 de sorte qu’au maximum la moitié des sites actifs est occupée par le substrat. Prenons une condition où KM >> [S] : Vmax = k2 [E]T k2 = kcat vi = Vmax [S] KM + kcat KM [E]T [S] vi = devient Dans ces conditions [E]T  [E]libre kcat KM [E] [S] vi = kcat KM est une constante de vitesse apparente d’ordre 2 Pr M.SLIMANI

KM KM Représentations linéaires KM kcat [E]T kA kcat Lineweaver - Burk vi = Vmax [S] KM + Si on écrit l’équation en double inverse : 1 Vmax [S] KM + vi = Vmax [S] KM + 1 vi = ou 1 Vmax [S] KM x vi = + En réarrangeant on obtient : Or Vmax = k2 [E]T = kcat [E]T 1 kcat [E]T [S] KM x vi = + [E]T kA [S] 1 x vi = + kcat ou Pr M.SLIMANI

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k2 est appelée constante catalytique ou kcat k2 est appelée constante catalytique ou kcat . Elle est proportionnelle au nombre de réactions que peut effectuer une molécule d’enzyme par unité de temps ( le «turn-over number»). Vmax = kcat [E]T µmole de P. mL-1.sec-1 sec-1 µmole de E . mL-1 kcat/KM est l’efficacité catalytique de l’enzyme. On l'appelle également kA. 1/Kcat : est la durée , en s de l’acte catalytique Kcat : donne la mesure de l’efficacité de l’acte catalytique Lorsqu’un enzyme peut utiliser plusieurs substrats, kcat/KM permet d’estimer quel sera le substrat le plus utilisé par la protéine. Pr M.SLIMANI

k2 ou kcat est égale à 100 sec-1. Constante catalytique Exemple : Dans le tube il y a une concentration saturante en substrat donc l’enzyme fonctionne en Vmax. On calcule la quantité de produit apparue dans le tube chaque minute : 2 mL x 30 µmoles/mL/min = 60 µmoles/min Il y a donc 60 µmoles de produit fabriquées par min par les 10 nmoles d’enzyme présentes dans le tube. 60 µmoles/min / 10 nmoles d’enzyme = 6000 réactions/min ou 100 réactions/sec Le turn-over number est donc de 6000 réactions/min ou 100 réactions/sec. Chaque molécule d’enzyme catalyse 100 réactions chaque seconde. k2 ou kcat est égale à 100 sec-1. Pr M.SLIMANI

Unités de vitesse : système international dans le système international (S.I.), l'unité officielle est le katal (kat) : quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Les biochimistes préfèrent utiliser les unités internationales (U.I. ou U.E.) 1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 μkat = 16,6 nkat 1 U.I = 1 µmol.min-1 ( signifie à ) 16.67 nmol.s-1 =16.67 nkat Exemple: vi = 600 µmoles de P / L / min correspond à vi = 600 U / L = 600 UIE / L vi = 10 µmoles de P / L / sec donc à vi = 10 µkat / L Pr M.SLIMANI

Mode d’action des inhibiteurs Certains inhibiteurs s'associent de manière réversible à l'enzyme en interagissant de manière non covalente. D'autres se fixent de manière Irréversible et sont souvent utilisés pour déterminer les groupes actifs du site catalytique. Enfin, selon le type d'inhibiteur, l'enzyme peut fixer : -le substrat ou l'inhibiteur : c'est la fixation exclusive avec formation de complexes binaires ES ou EI : Inhibiteurs compétitifs: fixation à la place du substrat -le substrat et l'inhibiteur : c'est la fixation non-exclusive avec formation de complexes ternaires (ESI). Si ce complexe ternaire reste encore actif (moins que le complexe ES), l'inhibition est dite partielle et s'il est totalement inactif, l'inhibition est dite totale. Inhibiteurs non-compétitifs: fixation ailleurs qu’au site substrat empêchant la catalyse d’avoir lieu Pr M.SLIMANI

Inhibiteur compétitif : (fixation exclusive) C'est un mécanisme où la fixation de l'inhibiteur empêche celle du substrat (et réciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont donc mutuellement exclusives. En effet, puisque la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont mutuellement exclusives, l'addition d'une très forte concentration de substrat déplace l'équilibre E + S <==> ES en faveur de ES et donc déplace l'équilibre EI <==> E + I en faveur de E. Un inhibiteur compétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme libre sa fixation et celle du substrat étant exclusives l'une de l'autre. Pr M.SLIMANI

k1 [E] [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ] La vitesse d’apparition du produit s’exprime : Vi = k2 [ ES ] En vitesse initiale, les vitesses de formation et de disparition de ES sont égales : k1 [E] [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ] k-1 + k2 k1 [E] [S] = KM [E] [S] d’où [ ES ] = 1/KM On admet que la [ EI ] est rapidement atteinte et que [ EI ]f = [ EI ]d k3 [E] [I] = k-3 [ EI ] Pr M.SLIMANI

Ki Ki KM [E] [ I ] [ EI ] = [E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ] [E] [I] On a vu que : [ EI ] = Ki [E] [ I ] On sait que : [E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ] On peut donc écrire : [E]T = [E] + + [E] [I] [E] [S] Ki KM Pr M.SLIMANI

Ki KM KM [I] Ki [S] Ki x KM KiKM Ki Ki KM [E]T = [E] ( 1 + + ) [I] [S] On définit Ki :comme la constante de dissociation du complexe EI : [E]T = [E] + + [E] [I] [E] [S] Ki KM [ EI ] = Ki [E] [ I ] [E]T = [E] ( 1 + + ) [I] [S] Ki KM [E]T = [E] ( ) KM [I] Ki [S] Ki x KM KiKM + + Pr M.SLIMANI

KM [I] Ki [S] Ki x KM KiKM Ki x KM + KM[I] + Ki [S] Ki [E]T = [E] ( ) + + On peut également l’écrire : [E] = Ki x KM + KM[I] + Ki [S] x [E]T Ki x KM La vitesse de la réaction est donnée par : Vi = k2 [ES] Pr M.SLIMANI

KM Ki Ki x KM + KM [I] + Ki [S] k2 (Ki x KM + KM [I] + Ki [S]) KM Vi = k2 [E] [S] KM Si on remplace [E] par sa valeur : [E] = Ki x KM + KM [I] + Ki [S] x [E]T Ki x KM On obtient donc : vi = x [E]T [S] k2 x Ki (Ki x KM + KM [I] + Ki [S]) x KM KM Pr M.SLIMANI

k2 Ki x KM + KM [I] + Ki [S] KM (1 + ) + [S] Ki Ki x Ki x [E]T [S] vi = x [E]T [S] k2 x Ki Ki x KM + KM [I] + Ki [S] Ki Comme Vmax = k2 [E]T Avec inhibiteur : vi = Vmax [S] KM (1 + ) + [S] Ki [I] vi = Vmax [S] KM + Sans inhibiteur : Pr M.SLIMANI

Inhibition compétitive --1/Km -1/K’m Pr M.SLIMANI

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Inhibiteur non compétitif : (fixation non exclusive) Un inhibiteur non compétitif classique n'a aucune influence sur la fixation du substrat (et réciproquement) : les sites de fixation du substrat et de l'inhibiteur sont distincts. En conséquence, l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre E et au complexe ES ; de même, le substrat se fixe à l'enzyme libre E et au complexe EI. Les inhibiteurs non compétitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le substrat. Un inhibiteur non compétitif au sens large peut se fixer à la fois sur l'enzyme libre et sur le complexe E-S, avec des constantes d'équilibre différentes Pr M.SLIMANI

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Inhibition non compétitive : 1/V’max 1/Vmax Pr M.SLIMANI

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Inhibiteur incompétitif : (fixation non exclusive) du terme anglo - saxon : "uncompetitive". Ce type d'inhibition est aussi appelé inhibition par blocage du complexe intermédiaire. Cette appellation décrit mieux le mécanisme : l'enzyme et le substrat forment d'abord le complexe enzyme substrat (le complexe intermédiaire), puis l'inhibiteur se fixe à ce complexe Pr M.SLIMANI

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Inhibition incompétitive Pr M.SLIMANI

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