Stéphanie Lamontagne, Sophie Parent, Eric Asselin, Monique Cadrin Étude par co-immunoprécipitation de l’interaction entre les kératines 8/18 et les protéines clés de la signalisation cellulaire dans les cellules d’hépatocarcinome HepG2 Stéphanie Lamontagne, Sophie Parent, Eric Asselin, Monique Cadrin Groupe de Recherche en Oncologie et Endocrinologie Moléculaires Département de Biologie Médicale Université du Québec à Trois-Rivières Introduction Les filaments intermédiaires (FIs) constituent avec les microtubules et les microfilaments d’actine le cytosquelette des cellules de mammifères. Les kératines sont des protéines de filaments intermédiaires retrouvées dans les cellules épithéliales. Elles forment des hétérodimères comportant une sous-unité de type 1 et une sous-unité de type 2. Chez les hépatocytes, ce dimère est formé par les kératines 8 et 18 [1]. Les kératines sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires. Entre autres, ces protéines assurent la protection des hépatocytes contre les stress mécaniques et toxiques[2]. Par contre, les mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction protectrice des kératines sont encore mal compris.   Dans les études sur le cancer, les kératines ont été longtemps utilisées comme marqueur du tissu d’origine des métastases. Des études récentes montrent que les kératines doivent être considérées comme des protéines jouant un rôle actif dans le développement des tumeurs. En effet, certains chercheurs ont émis l’hypothèse que les cellules épithéliales doivent se modifier par l’inhibition de l’expression des kératines pour prendre des caractéristiques de cellules mésenchymateuses (expression de vimentine) (transition épithéliale-mésenchymateuse ou EMT). Ces cellules deviennent alors plus motiles, peuvent s’échapper du tissu d’origine, transiter par la circulation sanguine et entraîner la formation de tumeurs secondaires, les métastases [1]. Des travaux réalisés dans notre laboratoire ont démontré que l’inhibition des kératines par un shRNA rend les cellules d’hépatocarcinomes HepG2 plus motiles. Ces mêmes études ont mis en évidence que la perte des kératines provoque une augmentation de l’expression de la Claudine-1, une protéine des jonctions serrées, qui est aussi connue pour favoriser le potentiel invasif et métastatique des cellules cancéreuses. L’activation du facteur de transcription NF-κB est responsable de l’augmentation de l’expression de la Claudine. Suite à ces résultats, des études préliminaires ont permis de mettre en évidence l’existence d’une relation entre le facteur de transcription NF-κB et les kératines 8/18. L’hypothèse étant que les kératines 8/18 séquestreraient Akt et le facteur de transcription NF-κB et que l’absence de kératines libérerait Akt et NF-κB affectant ainsi leurs fonctions respectives. L’objectif de mon projet de recherche était donc de déterminer si dans les cellules HepG2 Akt et NF-κB et ses protéines activatrices (IKK et PI3K) pouvaient être directement liées aux kératines. L’interaction entre Akt et les kératines 8/18 et l’interaction entre NF-κB (et protéines activatrices) et les kératines 8/18 pourraient expliquer du moins en partie les résultats obtenus précédemment. Figure 1 – A) Immunoprécipitation des kératines 18 B) immunoprécipitation de NF-κB B) A) Approche Expérimentale Modèle ― Les cellules utilisées proviennent de la lignée cellulaire HepG2, cellules provenant d’un hépatocarcinome humain. Immunoprécipitation Immunofluorescence ― Les cellules ont été fixées et perméabilisées avec du méthanol, 10 minutes à -20◦C, lavées deux fois avec du PBS et ensuite incubées avec les anticorps primaires toute la nuit à 4 ◦C. Après deux lavages dans le PBS, les cellules ont été incubées avec les anticorps secondaires appropriés 1h, à température pièce, dans une chambre humide à l’abri de la lumière. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois dans de l’eau distillée et les noyaux marqués au Hoechst. Les cellules ont été observées au microscope à fluorescence.   *** Tous les anticorps primaires proviennent de la compagnie Cell Signaling sauf pour K8 (Troma1 ,Developmental Studies Hybridoma Bank, Université de l’Iowa), K18 (L2A1, Université du Michigan), PI3K p85α (Santa Cruz Biotechnology) et 14-3-3σ (Santa Cruz Biotechnology). Figure 2 – Analyse de la colocalisation par immunofluorescence indirecte A) des FIs de kératines et NF-κB B) des FIs de kératines et AKT Résultats Immunoprécipitation : Les résultats indiquent que plusieurs protéines impliquées dans la signalisation cellulaire sont attachées aux FIs. AKT et sa forme activée AKTp : Cette protéine joue un rôle prépondérant dans la protection des cellules contre l’apoptose. NF-κB : Dépendamment des conditions dans lesquelles les cellules se retrouvent, le facteur de transcription est transporté dans le noyau et est impliqué dans la réponse des cellules au stress, la division cellulaire et la motilité cellulaire. IKKβ : Cette protéine fait partie d’un complexe de trois protéines qui joue un rôle dans l’activation de NF-κB. 14-3-3 σ : Cette famille de protéines joue un rôle dans la régulation de la fonction de protéines en les séquestrant dans le cytoplasme. Par exemple, la protéine phosphatase CDC25 qui est impliquée dans la régulation du cycle cellulaire est maintenue dans le cytoplasme lorsque liée à la protéine 14-3-3[3].   Immunofluorescence indirecte : Les résultats sont beaucoup moins concluants que ceux obtenus par immunoprécipitation. Il est possible de voir une colocalisation entre NF-κB et les FIs ou de AKT et les FIs mais il semblerait que la majorité de ces protéines ne serait pas attachée aux kératines. Ces résultats sont préliminaires et vont nécessiter une étude plus approfondie. Conclusion La présente étude a donc permis de montrer que des protéines dont le rôle est primordial pour le bon fonctionnement des cellules et qui sont impliquées dans la progression tumorale sont attachées aux FIs. Lors des prochains mois, il est prévu d’effectuer les mêmes expérimentations sur les cellules normales de foie, les THLE-3. Dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires dans lesquels les FIs de kératine sont impliqués, nous comparerons l’effet du stress toxique (agent chimiothérapeutique) sur les cellules d’hépatocarcinome HepG2 et les cellules normales THLE-3 en relation avec les FIs et leur protéines associées. Afin d’améliorer la résolution de l’immunofluorescence, la microscopie confocale sera utilisée (un microscope confocal sera bientôt installé à l’UQTR). De plus, la technique Proximity Ligation Assay pourra être utilisée pour une meilleure visualisation des protéines attachées aux kératines. Cette méthode permet l’émission d’un signal seulement aux endroits où il y a colocalisation des protéines étudiées. En utilisant ces méthodes, nous pourrons voir dans quelle portion de la cellule les protéines sont associées aux kératines et déterminer, entre autres, si cette localisation joue un rôle fonctionnel. Bibliographie [1] Fortier A-M. Relation entre le cytosquelette de filaments intermédiaires et la signalisation oncogénique des isoformes d'AKT au cours de la progression tumorale. Trois-Rivières: Université du Québec à Trois-Rivières; 2013. [2] Ku NO, Toivola DM, Strnad P, Omary MB. Cytoskeletal keratin glycosylation protects epithelial tissue from injury. Nature cell biology 2010;12:876-85. [3] Snider NT, Omary MB. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nature reviews Molecular cell biology 2014;15:163-77. Schéma 1 - Voie de signalisation mettant en lien A) AKT et NF-κB et ses protéines activatrices B) AKT et NF-κB et ses protéines activatrices en relation avec l’interaction des FIs de kératines