Mutagenèse chez la drosophile Approche historique Exp : Clonage du gène vestigial Réduction de la taille des ailes, localisé sur le chr 2 en 49D-F Mutagenèse à l’élément P Femelle M X Mâles P : croisement dysgénique F1 (mobilisation dans la lignée germinale) X mouches [Vg] 106 mouches : 100 mouches avec un phénotype [vg] Test d’allélisme : 1 seule insertion allélique à vg Vérification par hybridation in situ sur chromosomes polytènes

Construction d’une banque génomique à partir du mutant isolé Clonage du gène Construction d’une banque génomique à partir du mutant isolé Criblage de la banque avec une sonde correspondant à l’élément P Criblage d’une banque d’ADN génomique sauvage. vg83b27 vg1 vg67d2 vg12 vg21 l1 l2 l3 l4 Criblage d’une banque de cDNA : identification d’un transcrit de 3.8 kb

Mutagenèse à l’élément P Améliorations Chromosome 2 Chromosome 3 X D 2-3 5’P P lacZ white 3-P Délétion de l’intron 2-3 : absence de répresseur Délétion d’un des pieds : absence de transposition Excision et insertion à d’autres sites (dans la lignée germinale de la F1) enh 5’P P lacZ white 3-P Élimination par croisement de la source de transposase

Clonage du point d’insertion Par plamid rescue Par PCR Inverse oriC Pied de P Pied de P rapporteur Plasmide white ampr Système rapporteur lacZ GFP Gal4 Clonage du point d’insertion Par plamid rescue Par PCR Inverse Séquence d’intérêt

Séquençage du point d’insertion Plasmid Rescue oriC Pied de P Pied de P rapporteur Plasmide white ampr EcoR1 EcoR1 Digestion de l’ADN génomique Par EcoR1 Ligation Plasmide Transfection Selection des clones ampr Séquençage du point d’insertion

Clonage et séquençage du produit de PCR (point d’insertion) PCR inverse oriC Pied de P Pied de P rapporteur Plasmide white ampr EcoR1 EcoR1 Digestion de l’ADN génomique Par EcoR1 Ligation Amorce 1 Amorce 2 PCR avec amorces 1 et 2 Clonage et séquençage du produit de PCR (point d’insertion)

Excision imprécise par re-mobilisation de l’élément P Insertion d’un élément P n’est pas systématiquement associée à un phénotype Excision imprécise par re-mobilisation de l’élément P X D2-3 Excision précise Excision imprécise

Utilisation d’élément P permettant une dérégulation de l’expression

Lignées Gal4 X Lignées EP

Gene trap chez la drosophile

SA SD PolyA

PDI-GFP

Elements PiggyBAC Mite du choux

Elements PiggyBAC Avantage : insertion aléatoire au niveau d’un site TTAA Pas de biais d’insertion dans les séquences 5’ Inconvénients : excision propre

Techniques de mosaïques génétiques chez la drosophile

Analyse clonale Mutation létale à l'état homozygote au stade embryonnaire Fonction dans des stades plus tardifs Mutation est-elle autonome cellulaire Gènes à effet maternel: possibilité d’étudier la fonction zygotique Fonction d’un gène au cours du développement

Clones mitotiques par irradiation 3 types de cellules homozygotes sauvages homozygotes mutantes hétérozygotes

Comment repérer les clones issus d’un événement de recombinaison Adulte : Marqueurs de cuticule (yellow) Marqueur de soies couleur de l’œil (white) Disques imaginaux gènes rapporteurs (lacZ, GFP) épitopes (myc)

FLP/FRT mediated recombination

hspflp/ hspflp; frt, GFP, m+ / Cyo, m+ frt, a-/ Cyo, a+ X hspflp/ hspflp; frt, GFP, m+ / Cyo, m+ Hsp70-flp GFP a+ ChrII frt a- Chr X X a-+ a+ Cyo frt, m- / frt, GFP, m+; hspflp Hsp70-flp a+ a-

Mitose Hsp70-flp a+ a+ a- a- Hsp70-flp a+ a- a+ a-

Hsp70-flp a+ a- a+ a- Division cellulaire a- a+ a- a+

Surexpression clonale par flip-out Choc thermique pour induire Expression de la flipase

Gène X Gène X

Utilisation de mutations minutes dans l’analyse clonale Mutations « minute » : mutations dominantes qui ralentissent la division cellulaire Cellules hétérozygotes ont un désavantage par rapport aux cellules sauvages Intérêt : analyser des clones mutants qui seraient éliminés dans un contexte sauvage car ils ont un désavantage

Hsp70-flp m+ a- m- a+

Hsp70-flp m+ a- m+ a- m- a+ m- a+ a- m+ m- a+ m+ a- m- a+

Cribles basés sur la technique flip-out Agent mutagène Mouches FRT/FRT Individus mutagénisés sont croisés avec des mouches exprimant la flipase de façon tissu spécifique (par exemple eyeless flipase) Sélection des mouches ayant le phénotype recherché

Mouches hétérozygotes Croisées avec mouches eyeless-flipase Contrôle Identification du gène : Hippo Gène suppresseur de tumeur

Clones mutant pour hippo

Clones perte de fonction pour YKI

Clones de surexpression de YKI

Gene trap : Types de vecteurs SA LacZ-neo SA-ßgeo IRES (internal ribosome entry site) SA IRES ß-geo LacZ-neo

Sélection sur la résistance au G418 SA SA Lacz-néo Promoteur Introduction dans des cellules ES Lacz-neo AAAAA Protéine lacZ-Néo Sélection sur la résistance au G418 L’expression de lacZ est testé dans les cellules ES et/ou au cours du développement

Si le transgène s’exprime clonage des exons en 5’ par RACE PCR obtention de souris chimériques pour le transgène transmission à la descendance obtention d’homozygotes et analyse du phénotype

Sites FRT entre le centromère et le site d’intérêt Souche avec FRT Souche mutante hétérozygote frt, m+ / frt, m+ X m- / Cyo frt, m+/m- X ApXa / Cyo Souche portant la FRT et la mutation sur le même chromosome frt, m- / Cyo, m+ frt, m-/Cyo, m+ X frt, GFP, m+ / Cyo, m+; hspflp/ hspflp frt, m- / frt, GFP, m+; hspflp