Knock-Out ou invalidation d’un gène KO d’un gène : perte physique de la séquence (ou d’une partie de la séquence) de ce gène conduisant à l’absence de l’ARNm et donc de la protéine Le KO est transmissible à la descendance Chez les eucaryotes, le KO d’un gène signifie que la séquence des 2 allèles est affectée KO = mutagénèse dirigée par délétion Recombinaison homologue ou RH

Recombinaison homologue ou RH RH : échange de fragments d’ADN entre 2 molécules d’ADN au niveau des séquences nucléotidiques homologues KO basé sur de la RH entre de l’ADN exogène et de l’ADN génomique - Ce mécanisme est connu de puis longtemps chez la levure - A été mis en évidence par injection directe d’ADN dans des cellules de mammifères en 1980

Lorsque de l’ADN est transfecté dans des cellules eucaryotes, il peut: soit rester à l’état épisomique (transfection transitoire) soit s’intégrer dans le génome (transfection stable) Insertion au hasard Recombinaison homologue

Facteurs favorisant la RH Taille de la région homologue (de 4 à 9 kb, on multiplie par 20 la RH) Fort pourcentage d’homologie ADN sous forme linéaire (par rapport à circulaire) Ni le nombre de copies présentes dans la cellule, ni la localisation chromosomique du gène à invalider n’influe sur la RH Sélectionner les évènements de recombinaison, utilisation de gènes de résistance à des drogues, par ex néomycine (G418)

Les cellules ES Cellules isolées à partir d’embryons (de souris) totipotentes : cellules indifférenciées possédant le potentiel de devenir n’importe quel type cellulaire croissance illimitée en culture facilement transfectables et sélectionnables possible de les réimplanter (après modification génétique) dans un blastocyste (souris) elles pourront coloniser tous les types cellulaires (dont la lignée germinale) souris chimères Descendants hétérozygotes pour la modification génétique

Stratégie générale pour invalider un gène chez la souris (knock out) Cellules ES Culture sur MEFs+LIF Electroporation avec le vecteur de recombinaison Sélection des clones résistants et génotypage Injection dans des bastocystes implantation Souris chimères (-/+)

La recombinaison homologue chez la souris Technique permettant d’introduire de manière ciblée une modification dans le génome. Opérationnelle seulement chez la souris. Nécessite des cellules souches embryonnaires.

Les cellules souches embryonnaires (ES) Dérivées de la masse interne des blastocystes préimplantatoires Totipotentes Introduction dans des blastocystes Introduction d’ADN et mutation ciblée de l’ADN. Différenciation in vitro.

Différenciation des cellules ES Absence de LIF et de stroma corps embryoïdes Erythroïde/myéloïde Lymphoïde Muscle strié Mésoderme embryonnaire précoce Neurones (like)

La recombinaison homologue Inconvénients Travail de BM relativement lourd Techniquement complexe Avantages Mutation ciblée Pas d’effets de position

Principe de la recombinaison homologue 5’ Exon 1 Exon 2 Exon 3 3’  Allèle cible 1 kb Vecteur de recombinaison Exon 1 Néor Sélection G418 5’ Exon 1 Néor Exon 3 3’  Allèle recombiné

Les vecteurs de recombinaison homologue Vecteur d’insertion 5’ Exon 1 exo Néor n 2 Exon 3 3’  Vecteur de remplacement 5’ Exon 1 Néor Exon 3 3’ 

Recombinaison homologue avec double sélection 5’ Exon 1 Exon 2 Exon 3 3’  Allèle cible 1 kb Vecteur de recombinaison Exon 1 Néor TK Exon 1 Néor Exon 3 Exon 8 Néor TK Recombinaison homologue Recombinaison hétérologue Résistance au G418 Résistance au gancyclovir Résistance au G418 Sensibilité au gancyclovir

Les systèmes inductibles Pourquoi utiliser un système inductible? soit le KO est léthal soit l’expression du gène étudié est très large, et donc le phénotype mutant très complexe Contrôler la mutation dans le temps et dans l’espace

Recombinaison homologue conditionnelle : le système Cre-lox (1) L’enzyme CRE Recombinase du bactériophage P1 Excise les fragments d’ADN situés entre des répétitions directes de 34 bp (site loxP) - LoxP est une séquence d’ADN de 34 pb comprenant aux extrémités 13 nucléotides palindromiques (n’existe pas chez les eucaryotes) - Les 2 sites peuvent être trsè éloignés l’un de l’autre et être quand même recombinés par la CRE Ne nécessite pas d’ATP ou d’activité topoisomérase Fonctionne dans les systèmes hétérologues

Recombinaison homologue conditionnelle : le système Cre-lox (2) MCS BamH1 MCS Neo TK Vecteur flox intron exon intron Structure génomique Neo TK intron exon intron Vecteur de recombinaison Expression transitoire de CRE + sélection gancyclovir intron exon intron Délétion de type I (systémique) Délétion de type II (conditionnelle)

Recombinaison homologue conditionnelle : le système Cre-lox (3) lck CRE

Cre ER TM Chimère ne lie pas le ligand naturel 17 b-oestradiol à des doses physiologiques répond au 4 (OH)-TM (4-hydroxy-tamoxifen) en l’absence de ligand, Cre est séquestré dans le cytoplasme par Hsp90 en présence de ligand, disruption de l’interaction avec hsp90 et migration dans le noyau Souris transgéniques

Efficient recombination in CAGGCre-ERTM; R26R mouse embryos following administration of TM at 8.5 dpc Whole-mount views of 9.5 dpc embryos following histochemical staining of embryos for b-galactosidase activity Non transgenic embryos CAGGCre-ERTM; R26R mouse embryos 24h after TM injection CAGGCre-ERTM; R26R mouse embryos 24h after corn oil injection (some lacZ positive cells in the absence of TM)

TM induces dose-response in CAGGCre-ERTM

Induction of Cre activity in adult mice Intraperitoneal injection of TM into adult mice (9mg TM40 g of body mass) 1 day pi 5 days pi Cerebral cortex cerebellum heart kidney lung liver

Redondance fonctionnelle Peut nécessiter des doubles ou triples KO