MISE EN PLACE D’UN PIPELINE DE TRAITEMENT DESS Bioinformatique (2003-2004) MISE EN PLACE D’UN PIPELINE DE TRAITEMENT DE SEQUENCES ISSUES DE BANQUES ENRICHIES EN SEQUENCES MICROSATELLITES ASSOCIE A UNE BASE DE DONNEES Alexis DEREEPER Université Montpellier II CIRAD – Programme Biotrop Encadrement : Jean-François Rami, Claire Billot, Manuel Ruiz

PLAN I - Introduction II – Contexte biologique III – Mise en place du pipeline IV – Base de données V – Interface web VI – Conclusions et perspectives

Besoin d’un pipeline de traitement automatique I - Introduction CIRAD : Organisme scientifique français spécialisé en recherche agronomique appliquée aux régions chaudes. Programme BIOTROP : Utilisation de la biologie moléculaire pour étudier la diversité génétique des plantes (marqueurs moléculaires, cartographie) réalisation de banques enrichies en séquences microsatellites séquençage Obtention de marqueurs microsatellites exploitables Analyse des séquences Besoin d’un pipeline de traitement automatique

Plante A Plante B (GT)8 (GT)12 II – Contexte biologique Microsatellite : courte séquence de motifs d’ADN répétés en tandem Unité de répétition variant de 1 à 6 pb : (CA)n, (CTT)n… polymorphisme multiallélique détecté par PCR puis électrophorèse du locus (microsat + régions flanquantes) GTGTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACACA Plante A Plante B GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT CACACACACACACACACACACACA Primer 1 Primer1 Primer 2 amplification PCR A B (GT)8 (GT)12 2 allèles

REALISATION DE BANQUES GTGTGTGT TGTGTGTG RsaI Digestion enzymatique par RsaI GTGTGTGT TGTGTGTG Ligation d’adaptateurs et PCR TGTGTGTG Dénaturation et hybridation avec un oligonucléotide biotinylé GTGTGTGT REALISATION DE BANQUES Capture du microsatellite avec un complexe avidine/bille magnétique TGTGTGTG GTGTGTGT aimant Lavage, élution puis amplification par PCR GTGTGTGT clonage TGTGTGTG

Obtention d’une banque enrichie en séquences microsatellites CULTURE + SELECTION Obtention d’une banque enrichie en séquences microsatellites Gène de la β-galactosidase SEQUENCAGE Gène de résistance à un antibiotique GTGTGTGTTGTGTGTG amorce forward amorce reverse CHAÎNE DE TRAITEMENT ANALYSE DES SEQUENCES Chromatogrammes de séquence

III - Mise en place du pipeline Chaîne de traitement : les différentes étapes Chromatogrammes de séquence Séquences d’ADN brute Base-calling Séquences d’ADN nettoyée Élimination du vecteur et des adaptateurs Fragments de digestion ayant un microsatellite Digestion enzymatique in silico + recherche de microsatellites Séquences consensus Clustering, contigage Couples d’amorces de PCR Définition d’amorces d’amplification

Objectifs Mettre en place un pipeline = chaîne de traitement reliant plusieurs logiciels afin d’effectuer une tâche Sauvegarde automatique des résultats en base de données à chaque étape du pipeline traçabilité des séquences Outil convivial et paramétrable : Possibilité pour l’utilisateur de choisir les étapes à effectuer Possibilité d’une double digestion Interfaçage du pipeline et de la base de données

Chromatogrammes de séquence Modélisation Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Chromatogrammes de séquence Phred.pm Séquences d’ADN brute

Base-calling : module Phred.pm >DW0AI001ZA05FM1.SCF TATCATATGGGACTGGCCGAGTGCATCTCCGCGC Fichier séquence .seq Fichier qualité .qual >DW0AI001ZA02RM1.SCF 6 6 9 6 10 12 16 11 19 9 9 9 19 19 22 22 29 29 35 34 34 34 37 19

Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Modélisation Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Chromatogrammes de séquence Phred.pm Séquences d’ADN brute Séquences d’ADN nettoyée Lucy.pm

Nettoyage des séquences : module Lucy.pm Détection de la position du vecteur Détection des régions de mauvaise qualité >DW0AI001ZA05FM1.SCF 0 0 0 113 442 TATCATATGGGACTGGCCGAGTGCATCTCCGCGCAGGCCG Méthode retrait_vecteur(): Retrait du vecteur en fonction de la sortie de Lucy

Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Modélisation Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Chromatogrammes de séquence Séquences d’ADN brute Séquences d’ADN nettoyée Lucy.pm Phred.pm Digestion.pm + Select_ssr.pm Fragments de digestion ayant un microsatellite

Digestion enzymatique : module Digestion.pm Utilisation du module Bioperl Bio::Tools::RestrictionEnzyme Utilisation de la fonction cut_seq() @fragment = $re1->cut_seq($seq); Sélection des fragments contenant un microsatellite: module Select_ssr.pm Utilisation d’un script de recherche de microsatellites >DW0AI001ZA05FM1.0 0 2 ac 8 51 64 330 GCACATATGTGAAGTCCATTCAGTGGCCACTGGAGCAAGGT AACCAACGACACACACACACACACAGGT

Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Modélisation Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Chromatogrammes de séquence Séquences d’ADN brute Séquences d’ADN nettoyée Lucy.pm Phred.pm Digestion.pm + Select_ssr.pm Fragments de digestion ayant un microsatellite Séquences consensus Stackpack.pm, Cap3.pm

Clustering : module Stackpack.pm Clustering : premier regroupement des séquences selon leur similarité relative Stackpack : pipeline de contigage clustering contigage analyse d2_cluster phrap craw Contigage : module Stackpack.pm ou Cap3.pm Alignement des séquences regroupées au sein d’un cluster forward reverse consensus Séquences consensus

Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Modélisation Un module Perl par étape, par logiciel utilisé Chromatogrammes de séquence Séquences d’ADN brute Séquences d’ADN nettoyée Lucy.pm DataBase.pm Base de données Requêtes Phred.pm Digestion.pm + Select_ssr.pm Fragments de digestion ayant un microsatellite Stackpack.pm, Cap3.pm Séquences consensus Couples d’amorces de PCR Primer3.pm

Définition d’amorces : module Primer3.pm Utilisation du logiciel ePrimer3 de EMBOSS Cible d’amplification : positions du microsatellite sur le consensus # Start Len Tm GC% Sequence 1 PRODUCT SIZE: 116 FORWARD PRIMER 26 20 54.65 55.00 GTACCCTGTGTCTCTCCTTG REVERSE PRIMER 122 20 55.24 50.00 TGGTATGAAGGGTGTAGCTC

IV – Base de données Existence d’une base de données renfermant des informations communes: séquence brute, séquence nettoyée, contigs… Modification par ajout de nouvelles tables spécifiques

1 1..* 1 1..* 0..1 1..* 0..* 1..* 0..* Projet + nom_projet + date_creation + description Seq_init + nom_seq + source_fichier_chromato + sequence_brute + sequence_qualite + sequence_nettoyee + qual_nettoyee + nom_espece 1 1..* Cluster_element + Id_element + nom_element + sequence_consensus + num_cluster + nom_contig + longueur + align_phrap + res_align + align_craw + longest 1..* 0..1 1 A_pour_origine Seq_dig + nom_seq_dig + sequence_dig + qual_dig + enzyme + pres_micro 1..* Est_amplifié_par 1..* Primer + Id_primer + primer_compt + forw_nom + forw_seq + forw_temp + forw_size + rev_nom + rev_seq + rev_temp + rev_size + prod_size + prod_start + prod_end + valide + forw_infosblast + rev_infosblast 0..* Possède 0..* Microsat + Id_microsat + ssr_num + ssr_type + ssr + size + start + end

V – Interface web Nécessité d’une interface web commune au pipeline et à la base de données Manipulation de pages web par l’utilisation de scripts CGI Utilisation de feuilles de styles L’interface doit permettre de : Paramétrer le pipeline Lancer le pipeline Consulter les résultats d’un projet stockés en base de données Visualiser directement les résultats du pipeline

Créer un nouvel utilisateur de la BD biologiste Interface web Consulter la base de données Lancer le pipeline S’identifier « include » Choisir les étapes à effectuer Paramétrer les différentes étapes Faire un paramétrage avancé de Cap3 « extend » Administrateur Créer un nouvel utilisateur de la BD Se connecter sur l’accueil

VI – Conclusions et perspectives Découverte du langage Perl : Perl objet, BioPerl, Perl CGI Découverte d’un nouveau SGBD : MySQL Outil performant de traitement de séquences issues des banques microsatellites Possibilité pour l’utilisateur de choisir les étapes à effectuer. Possibilité de paramétrer chacune des étapes. Enregistrement des résultats en base de données à chaque étape Interface web conviviale et simple d’utilisation permettant de lancer le pipeline ou de consulter les résultats

Plusieurs perspectives sont envisageables pour la suite : Effectuer un blast d’une séquence donnée que ce soit contre GenBank ou contre des banques de séquences des utilisateurs Créer une sortie automatique d’un fichier de soumission pour l’enregistrement direct dans GenBank. Un téléchargement des chromatogrammes sur le serveur pourrait être intéressant pour l’utilisateur au moment où il fournit le chemin de ses chromatogrammes. Fournir un fichier Excel répertoriant l’ensemble des couples d’amorces validés à commander. Enrichir l’interface Web de consultation des résultats par de nouvelles pages d’interrogations de la base de données

Merci aux intervenants du DESS pour les cours qu’ils ont enseignés Merci de votre attention Merci à Jean-François Rami, Claire Billot, Manuel Ruiz, Pierre Larmande, pour m’avoir accueilli et encadré au CIRAD Merci aux intervenants du DESS pour les cours qu’ils ont enseignés