Bioingénierie de l’ADN CHMI 3216 F Semaine du 9 novembre 2009 Expression artificielle de protéines CHMI 3216 F – A2009

Expression d’ADNc ADNc Introduction dans un organisme d’intérêt (bactérie, levure, insectes, plantes, mammifères) Phénotype Activité Localisation Purification CHMI 3216 F – A2009

Pourquoi exprimer artificiellement une protéine? CHMI 3216 F – A2009

Expression artificielle de protéines Source: Genetic Engineering News Bactéries Avantages: Organisme bien étudié Peu couteux; facile à faire croître à grande échelle; Croissance rapide (E. coli: 20 min par génération) Grand choix de vecteurs et de souches bactériennes modifiées permettant l’expression abondante de protéines. Désavantages: Absence de modifications post-traductionnelles (glycosylation), ce qui peux affecter le repliement et la protéine; Agrégation des protéines et formation de corps d’inclusion; Contamination potentielle de la protéine d’intérêt par des protéines bactériennes. Levures Avantages: Eucaryote: présence de modifications post-traductionnelles Croissance rapide (S. cerevisiae: 2 hrs par génération) Rendements élevés Peu couteux et facile à faire croître à grande échelle; Peut être manipulé pour secréter les produits protéiques d’intérêt dans le milieu de culture (doc: purification facilitée) Fait de l’épissage (splicing) Désavantages: Des protéases peuvent dégrader les protéines étrangères Hyperglycosylation Agrégation possible des protéines surexprimées; Repliement anormal des protéines étrangères. CHMI 3216 F – A2009

Cellules de mammifères Expression artificielle de protéines Source: Genetic Engineering News. 2004, 24(18): 22-28. Cellules d’insectes Avantages: Rendements élevés Modifications post-traductionnelles proches de celles observées chez les mammifères Pré-ARNm est modifié de manière appropriée; Les cellules peuvent être manipulées pour la sécrétion de protéines dans le milieu de culture; Habileté d’expression de plusieurs gènes à la fois; Désavantages: Croissance plutôt lente Plus coûteux que E. coli /levures Requiert une expertise particulière pour la culture de cellules d’insectes et l’utilisation de vecteurs baculoviraux. Cellules de mammifères Avantages: Modifications post-traductionnelles appropriées Pré-ARNm est modifié de manière appropriée; Désavantages: Croissance lente Requiert un expertise particulière pour la culture de cellules de mammifères Coûteux; Les protéines purifiées peuvent être contaminées par des microorganismes; CHMI 3216 F – A2009

Expression chez E. coli Fréquemment utilisé pour exprimer une protéine à des niveaux élevés chez E. coli à des fins de purification; La protéine est souvent exprimée comme protéine de fusion avec la glutathion S-transférase (GST) afin de faciliter la purification. Un site de coupure par une protéase est ajouté entre la GST et la protéine d’intérêt afin de retirer facilement la GST suite à la purification. CHMI 3216 F – A2009

Expression chez E. coli CHMI 3216 F – A2009

Vecteur pGEX CHMI 3216 F – A2009

Expression chez E. coli Clonage dans pGEX Sites de restriction ajoutés ADNc d’intérêt ATG GST STOP Site de coupure par protéase Élimine codon STOP de l’ADNc d’intérêt ORF de l’ADNc d’intérêt en phase avec GST OU ADNc d’intérêt ATG GST STOP CHMI 3216 F – A2009

Expression chez E. coli CHMI 3216 F – A2009

Expression chez E. coli Cellules sont lysées; Bille de Glutathion sepharose Cellules sont lysées; L’extrait protéique est soumis à une chromatographie d’affinité sur GSH-sépharose: GST lie la GSH (Glu-Cys-Gly) et est retenu sur la matrice; Élution de la protéine recombinante: Ajout d’un excès de GSH à la colonne; OU: Ajout d’une protéase afin d’hydrolyser le peptide et libérer la protéine d’intérêt. Puit # 1: marqueur de masse moléculaire Puit # 2: Extraits protéiques totaux de E. coli Puit # 3: Extrait protéique après purification sur GST-sépharose. CHMI 3216 F – A2009

Expression chez E. coli CHMI 3216 F – A2009

Expression artificielle de protéines Source: Genetic Engineering News Bactéries Avantages: Organisme bien étudié Peu couteux; facile à faire croître à grande échelle; Croissance rapide (E. coli: 20 min par génération) Grand choix de vecteurs et de souches bactériennes modifiées permettant l’expression abondante de protéines. Désavantages: Absence de modifications post-traductionnelles (glycosylation), ce qui peux affecter le repliement et la protéine; Agrégation des protéines et formation de corps d’inclusion; Contamination potentielle de la protéine d’intérêt par des protéines bactériennes. Levures Avantages: Eucaryote: présence de modifications post-traductionnelles Croissance rapide (S. cerevisiae: 2 hrs par génération) Rendements élevés Peu couteux et facile à faire croître à grande échelle; Peut être manipulé pour secréter les produits protéiques d’intérêt dans le milieu de culture (doc: purification facilitée) Fait de l’épissage (splicing) Désavantages: Des protéases peuvent dégrader les protéines étrangères Hyperglycosylation Agrégation possible des protéines surexprimées; Repliement anormal des protéines étrangères. CHMI 3216 F – A2009

Expression chez la levure Saccaromyces cerevisiae 2u origin: origine de réplication chez la levure; URA 3: gène permettant la sélection de cellules de levure par auxotrophie (permet la croissance sur un milieu de culture déficient en uracile); Cyc1 TT: séquence de terminaison de la transcription de l’ARNm Cyc; Promoteur pGal: permet l’induction de l’expression chez les levures cultivées dans un milieu contenant du galactose mais déficient en glucose. CHMI 3216 F – A2009

Expression chez la levure Pichia pastoris P. pastoris: Levure méthylotrophe: utilise le méthanol comme seule source de carbone, le transformant en formaldéhyde et péroxyde d’hydrogène (dans les péroxysomes); Profil de glycosylation protéique se rapproche davantage de celui ayant lieu chez les mammifères; Donne une biomasse 10 fois plus élevée que S. cerevisiae, permettant d’obtenir un rendement beaucoup plus élevé en protéines recombinantes (10 à 100 fois!). CHMI 3216 F – A2009

Expression chez la levure Pichia pastoris Promoteur de l’alcool oxidase (AOX1): Induit par le méthanol; Permet des niveaux élevés d’expression de protéines étrangères (30% des toutes les protéines exprimés chez P. pastoris en présence de méthanol est l’alcool oxidase!!) Réprimé par le glucose; Zeocin: antibiotique Permet la sélection de levures contenant le vecteur; Épitope c-myc: EQKLISEEDL Séquence d’acides aminés provenant de la protéine c-myc. Utilisé pour faciliter la détection de la protéine étrangère par analyse Western (patience…plus de détails dans un moment…!) CHMI 3216 F – A2009

Expression chez la levure Pichia pastoris a-factor: « Mating factor » sécrété par els cellules de levure; Permet la sécrétion de la protéine d’intérêt dans le milieu de culture, facilitant sa purification; 6 x HIS: 6 résidus de l’acide aminé histidine ajoutés à la protéine d’intérêt; Facilite la purification de la protéine par chromatographie d’affinité sur une résine de nickel. CHMI 3216 F – A2009

Purification protéique avec le tag His6 Les extraits protéiques sont appliqués sur une colonne dont la matrice est couplée à des ions nickel Ni+2; Les résidus His du tag ajouté à la protéine d’intérêt vont lier le Ni+2, retenant la protéine sur la résine; L’élution se fait en ajoutant un excès d’imidazole à la colonne (l’imidazole est le bloc de base de l’acide aminé His). Avantages du tag His6: Plus petit que le GST Moins immunogène; Moins d’interférence avec le repliement de la protéine d’intérêt; Pas besoin de l’enlever après la purification de la protéine; L’interaction de His6 avec la résine ne dépend pas de la structure du tag (les protéines dénaturées peuvent être purifiées). CHMI 3216 F – A2009

Cellules de mammifères Expression artificielle de protéines Source: Genetic Engineering News. 2004, 24(18): 22-28. Cellules d’insectes Avantages: Rendements élevés Modifications post-traductionnelles proches de celles observées chez les mammifères Pré-ARNm est modifié de manière appropriée; Les cellules peuvent être manipulées pour la sécrétion de protéines dans le milieu de culture; Habileté d’expression de plusieurs gènes à la fois; Désavantages: Croissance plutôt lente Plus coûteux que E. coli /levures Requiert une expertise particulière pour la culture de cellules d’insectes et l’utilisation de vecteurs baculoviraux. Cellules de mammifères Avantages: Modifications post-traductionnelles appropriées Pré-ARNm est modifié de manière appropriée; Désavantages: Croissance lente Requiert un expertise particulière pour la culture de cellules de mammifères Coûteux; Les protéines purifiées peuvent être contaminées par des microorganismes; CHMI 3216 F – A2009

Utilisation des cellules d’insectes pour l’expression protéique Le système de baculovirus CHMI 3216 F – A2009

Utilisation des cellules d’insectes pour l’expression protéique Le système de baculovirus CHMI 3216 F – A2009

Utilisation des cellules d’insectes pour l’expression protéique Le système de baculovirus CHMI 3216 F – A2009

Utilisation des cellules d’insectes pour l’expression protéique Le système de baculovirus Nécessite la recombinaison homologue pour créer un baculovirus recombinant. Cette recombinaison se produit entre: 1) une version linéaire du génome baculoviral auquel manque un gène permettant la sélection (p.ex. gentamicine); 2) un vecteur de transfert portant le gène de résistance à la gentamicine ainsi que le gène encodant la protéine d’intérêt (ce dernier sous le contrôle du puissant promoteur de la polyhédrine). Le virus recombinant est ensuite utilisé afin d’infecter des cellules d’insectes. Ces dernières produiront alors de grandes quantités de la protéine d’intérêt. CHMI 3216 F – A2009

Utilisation des cellules d’insectes pour l’expression protéique Le système de baculovirus 5’ 3’ Transfer vector Polyhedrin gene x Cloned gene AcMNPV DNA Recombinant CHMI 3216 F – A2009

Utilisation des cellules d’insectes pour l’expression protéique Le système de baculovirus Pph: promoteur de la polyhédrine, permettant des niveaux d’expression élevés; TnTr/TnTL: séquences utilisés lors de la recombinaison homologues entre le vecteur de transfert et le génome baculoviral; Gentamicin: gène de résistance à l’antibiotique gentamicine; CHMI 3216 F – A2009

Utilisation des cellules d’insectes pour l’expression protéique CHMI 3216 F – A2009

Protéines recombinantes produites par le système de baculovirus a/b-interféron Adénosine déaminase Rhodopsine bovine CFTR Érythropoiétine Protéine de l’enveloppe virale du VIH Hémagglutinine de l’influenza Interleukine 2 Protéines du parasite de la malaria Anticorps monoclonaux de souris Protéines du poliovirus Glycoprotéine du virus de la rage Antigène de la capside du rotavirus simien Activateur du plasminogène tissulaire CHMI 3216 F – A2009

Cellules de mammifères Expression artificielle de protéines Source: Genetic Engineering News. 2004, 24(18): 22-28. Cellules d’insectes Avantages: Rendements élevés Modifications post-traductionnelles proches de celles observées chez les mammifères Pré-ARNm est modifié de manière appropriée; Les cellules peuvent être manipulées pour la sécrétion de protéines dans le milieu de culture; Habileté d’expression de plusieurs gènes à la fois; Désavantages: Croissance plutôt lente Plus coûteux que E. coli /levures Requiert une expertise particulière pour la culture de cellules d’insectes et l’utilisation de vecteurs baculoviraux. Cellules de mammifères Avantages: Modifications post-traductionnelles appropriées Pré-ARNm est modifié de manière appropriée; Désavantages: Croissance lente Requiert un expertise particulière pour la culture de cellules de mammifères Coûteux; Les protéines purifiées peuvent être contaminées par des microorganismes; CHMI 3216 F – A2009

Expression chez les cellules de mammifères 1. Cloner ADNc d’intérêt 2. Modifications (mutations): Augmenter la stabilité (p.ex. dans le sang) Améliorer l’activité enzymatique Diminuer l’immunogénicité 3. Introduction dans les cellules de mammifères (transfection) 4. Purification CHMI 3216 F – A2009

Stabilité dans le plasma Activité contre les caillots Expression chez les cellules de mammifères – Activateur du plasminogène tissulaire (tPA) Modifications Stabilité dans le plasma Liaison de la fibrine Activité contre les caillots Thr(103)Asn 10 0.34 0.56 Lys-His-Arg-Arg (296-299) Ala-Ala-Ala-Ala 0.85 0.93 1.01 + Asn (117)Gln 3.4 1 1.17 Thr(103)Asn + Asn (117)Gln 8.3 0.87 CHMI 3216 F – A2009

Vecteur d’expression chez les mammifères Promoteur Signal de polyadénylation Gène de résistance à un antibiotique CHMI 3216 F – A2009

Exemples de promoteurs CHMI 3216 F – A2009

Promoteurs fréquemment utilisés pour l’expression chez le cellules de mammifères Promoteur viraux Constitutif: CMV SV40 Inductible: MMTV (glucocorticoïdes) Promoteurs cellulaires: Constitutifs: Ubiquitine (UbC) Thymidine kinase eIF1a Inductible: Choc thermique (42oC) Metallothionéine (zinc) Expression restreinte: Lck: thymocytes CHMI 3216 F – A2009

Gènes de résistance aux antibiotiques CHMI 3216 F – A2009

Optimisation de l’initiation de la traduction Séquence consensus de Kozak: (GCC)GCCA/GCCATGG Permet une initiation optimale de la traduction; Peut être facilement ajoutée à l’ADNc d’intérêt par mutagenèse par PCR. CHMI 3216 F – A2009

Epitope tagging Epitope tags: courtes séquences d’acides aminés qui facilitent la détection de la protéine d’intérêt avec des anticorps génériques. Le tag est ajouté soit en N-terminal ou en C-terminal (dans ce dernier cas: avant le codon STOP!!) La séquence en nucléotide du tag peut être facilement ajouté à l’ADNc d’intérêt par mutagenèse par PCR. HA-tag: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala HIS-tag: His-His-His-His-His-His Myc-tag: Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu CHMI 3216 F – A2009

Transfection de cellules de mammifères Stable vs transitoire CHMI 3216 F – A2009

Méthodes de transfection Précipitation au phosphate de calcium Électroporation Lipofection CHMI 3216 F – A2009

Méthodes de transfection Le choix de la méthode à employer dépends de plusieurs considérations: Le type de molécule à transfecter (oligonucléotide, RNA, DNA); La lignée cellulaire (en suspension, adhérente, cultures primaires vs lignées établies); Les applications éventuelles (importance relative de l’efficacité de transfection). CHMI 3216 F – A2009

Protéine de fusion Green fluorescent Protein (GFP) Protéine isolée de la méduse (jellyfish) Fluoresce en vert lorsqu’exposée à de la lumière UV! Très utile pour visualiser ta protéine favorite. CHMI 3216 F – A2009

Protéine de fusion Green fluorescent Protein (GFP) CHMI 3216 F – A2009

Protéine de fusion Green fluorescent Protein (GFP) CHMI 3216 F – A2009

Protéine de fusion Green fluorescent Protein (GFP) CHMI 3216 F – A2009

Protéine de fusion Green fluorescent Protein (GFP) CHMI 3216 F – A2009

Protéine de fusion Green fluorescent Protein (GFP) Appareil de Golgi CHMI 3216 F – A2009

Protéine de fusion Green fluorescent Protein (GFP) CHMI 3216 F – A2009