E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20091 Bioingénierie de l’A.D.N. CHMI 3216 F 14 Septembre 2009 Boîte à outils, 2 ième partie (suite). Plasmides, clonage d’ADN 101, séquençage
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20092 Utilisation de la -galactosidase - Les bactéries couramment utilisées en génie génétique expriment une portion de la protéine - gal manquant les 50 acides aminés N-terminaux. Cet enzyme -gal tronqué est appelé le fragment omega [ ]; - Plusieurs vecteurs expriment la partie N-terminale de 50 acides aminés manquante de la -gal (le fragment ) au cœur même du MCS; - Seules les bactéries possédant à la fois les fragments et de -gal pourront exprimer une enzyme fonctionnelle (c’est ce qu’on appelle complementation);
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20093 Utilisation de la -galactosidase Si le fragment d’ADN d’intérêt est inséré dans le MCS de pBluescript, il interrompt le ORF du fragment de -gal, le rendant inactif; DONC: une bactérie avec un plasmide recombinant n’exprimera pas un enzyme -gal fonctionnel, et formera des colonies blanches (non-colorées) en présence du X- gal; CEPENDANT, les bactéries possédant un plasmide non- recombinant produiront une fragment intact, auront un enzyme -gal fonctionnel, et prendront une couleur bleue en présence de X-gal. X-Gal: substrat synthétique du - gal. Donne un produit bleu après hydrolyse par l’enzyme. IPTG: Analogue du lactose, ajouté aux plaques de pétri pour induire l’expression du fragment de -gal.
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20094 Clonage d’ADN Purification de plasmides à partir de bactéries Cultive 1 colonie bactérienne en milieu liquide Récolte le culot bactérien par centrifugation Resuspend les cellules dans un tampon à base de glucose Lyse bactérienne avec un tampon SDS/NaOH Précipite le chromosome bactérien et les protéines en présence d’un tampon et centrifuge Extrait le surnageant avec du phénol basique (pH 8) - solubilise les protéines contaminantes Extrait le surnageant avec du chloroforme – pour se débarrasser du phénol Précipitation de l’ADN avec l’éthanol, en présence de sel Sèche le culot d’ADN, resuspend dans un tampon, digère avec des enzymes de restriction et analyse par électrophorèse sur gel d’agarose
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20095 Clopnage d’ADN – identification de plasmides recombinants Trois tests importants DOIVENT être faits: –Coupe avec un enzyme ed restriction pour vérifier si le fragment inséré est de la bonne taille; –Coupe avec un (ou plusieurs) autre enzyme de restriction pour confirmer l’identité du fragment cloné; –Séquençage de l’insert.
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20096 Séquençage d’ADN
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20097 Séquençage d’ADN
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A20098 Séquençage d’ADN 3’ A G T C G C A C T A G T G C A T A G 5’
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E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A Que fait-on avec toutes ces données de séquençage? 1. Identification (est-ce-que j’ai cloné le bon fragment d’ADN?) 2. Est-ce-que le fragment cloné est complet, ou est-ce qu’il en manque un bout? 3. Est-ce qu’il y a des mutations?
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A Recherche sur BLAST Blast: algorithme permettant d’identifier rapidement des séquences similaires à l’AND d’intérêt; Blastp: recherche de similarité de séquence entre séquences d’acides aminés; Blastn: recherche de similarité de séquence entre séquences de nucléotides.
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E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A Recherche sur BLAST E value: indique la probabilité que la séquence trouvée soit seulement le résultat du hasard. –Plus la valeur de E est faible, meilleures sont les chances que le match est réel. G: link à Entrez Gene U: link des informations sur la séquence en question (profil d’expression, localisation sur le chromosome, orthologues) E: link à GEO (Gene Expression Omnibus): base de données de profils d’expression de gènes.
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E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A Obtenir la séquence d’acides aminés à partir de données de séquence brutes Vous permet de déterminer si la séquence clonée contient le cadre de lecture ouvert (ORF) complet. –Cadre de lecture ouvert (ORF): La séquence en nucléotide encodant une protéine; Débute avec un codon AUG, et se termine avec l’un des trois codons STOP (UAA, UAG, UGA).
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E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A Traduction de séquences en nucléotides
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E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A Résultat de Blastp
E.R. Gauthier, Ph.D.CHMI 3216F – A Devoir #3!