« En quoi la protéine fluorescente GFP peut-elle servir pour la recherche et le traitement du cancer chez l’Homme ? »

Plan de la présentation I- Présentation de la protéine GFP………………..............Vincent Lemains II- Le mode de fluorescence de la GFP…………...............Louis Bonnaire III- Comment visualiser cette fluorescence ? ……..............Arnaud Lemains IV- Utilisations de la GFP dans la lutte contre le cancer ….Maeva Faure

La méduse Aequorea Victoria Green Fluorescent Protein - 238 acides aminés - 28 kDa - naturellement présente dans la méduse Aequorea Victoria La “couronne” de la méduse Aequorea Victoria Méduse Aequorea Victoria : dans l’océan Pacifique, en voie de disparition La méduse Aequorea Victoria

cellule de Aequorea Victoria exprimant la GFP Mode de fluorescence de la protéine GFP en milieu naturel Transfert d’énergie entre deux molécules proches. Aequorine Green Fluorescent Protein émission de lumière verte Transfert d’énergie (lumière bleue) Ions calcium Ca ²+ oxygène

La structure de la GFP en vert les feuillets beta formant une “cage” en beige le chromophore ( hélice alpha ) responsable de la fluorescence Structure cristallographique en tonneau, chromophore au milieu -11 feuillets beta - 1 hélice alpha

Techniques de transformation Marquage d’une protéine Protéine à marquer GFP Exemple de cellules vivantes synthétisant une protéine marquée grâce à la GFP Marquage d’une cellule, avant, pendant et après électrolyse Noyau Cellule à marquer ADN Fusion du gène de la protéine à marquer avec celui du gène de la GFP. ADN ADN chocs électriques ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN

Schéma illustrant la technique de bombardement des cellules “canon à gènes” particules d’or chargées des fragments d’ADN cellule marquée Protéines d’autres couleurs + technique par bombardement apareil de transformation biolistique permettant la transformation de cellules par bombardement

Autres protéines fluorescentes boites de Pétri réalisées par le laboratoire de Roger Tsien montrant différentes couleurs possibles des protéines fluorescentes. spectres d’émission d’autres protéines fluorescentes

Comment visualiser la fluorescence de cette protéine, en action dans une cellule?

Visualisation des cellules fluorescentes: Microscope optique classique (épifluorescent) Microscope confocal à balayage laser Cytométrie de flux

Principe de fonctionnement du microscope en épifluorescence microscope optique + excitation de la fluorescence

Principe de fonctionnement du microscope confocal à balayage laser Exemple d’image obtenue avec un microscope confocal.

Comparaison d’images obtenues avec deux types de microscopes différents : -un microscope épifluorescent non confocal -un microscope épifluorescent confocal

Les problèmes liés à l’utilisation de cette technique.

Principe de fonctionnement de la cytométrie de flux. Exemple de résultats obtenus après une analyse.

Utilisation des protéines fluorescentes dans la détection et le traitement du cancer

Comparaison entre une métastase pulmonaire vue Sous lumière blanche, puis grâce à la fluorescence

a)Vaisseau sanguin sanguin contenant des cellules de fibrosarcome dont l'une s'apprête à se développer dans la peau b)Cellule de fibrosarcome (tumeur cutanée) déformée pour entrer dans un capillaire dans le but de métastaser

Observation de la dissémination métastatique du cancer humain du pancréas chez la souris Aperçu in vivo d'une tumeur du cancer du colon chez une souris

Comparaison entre l'estimation de la tumeur effectuée in vivo grâce à la GFP, et le volume réel