Interactions du Transforming Growth Factor beta et de l'angiotensine II sur les cellules musculaires lisses vasculaires Approche in vitro et par la transgénèse Mohammad HNEINO , Jacques Yuan LI, Dominique LANGLOIS. INSERM/UCBL UMR369 (Biologie et Pathologie des communications cellulaires dans les glandes endocrines IFR62, Faculté de Médecine RTH-Läennec, 7 rue Guillaume Paradin, 69372 Lyon cedex 08.

Plan du présentation Introduction Résultats acquis Implication du TGFß dans le système cardiovasculaire (SCV) Implication de l’AngII dans le SCV Interaction de TGFß-AngII dans les maladies CV Résultats acquis lignée de cellules musculaires lisses vasculaires Invitro : Invivo : souris transgèniques où la voie de signalisation du TGFß est invalidée dans les CMLv Perspectives : raison du demande de financement

Transforming Growth Factor beta (TGFß) Les plaquettes sanguines sont la source majeure Rôle du TGFß dans la vasculogenèse Invalidation de plusieurs gènes (TßRII) chez les souris entraîne une létalité précoce associée à des malformations vasculaires Biologie vasculaire -Anévrisme et syndrome de Marfan -Remodelage vasculaire Rôle du TGFß dans le dévelopement de l’athérosclérose TGFß serait une cytokine protectrice contre l’athérosclérose

Angiotensine II (AngII) ANG II est produite essentiellement par le SRA plasmatique SAt paracrine local en particulier dans la paroi artérielle Rôle de l’AngII dans le système cardio-vasculaire: Maintenir l’homéostasie cardiovasculaire Principal régulateur de la pression artérielle (PA) Agent vasoconstricteur des CMLv Remodelage vasculaire Facteur de risque majeur dans les maladies CV

Interaction entre TGFß et AngII 2 facteurs qui sont impliqués dans les maladies cardiovasculaires (athérosclérose) AngII facteur de risque TGFß cytokine protectrice Ang II module d’une façon complexe la voie du TGFß: AngII stimule l’expression du TGFß et de ses récepteurs (I et III) AngII utilise le TGFß comme médiateur autocrine pour le développement de la fibrose et son effet hypertrophique Activation des protéines Smad 2 et 3 par l’ Ang II indépendamment du TGFß.

Résultats acquis Invitro Invivo Effets exercés par le TGFß sur les cellules CMLv WT et des clones stables surexprimant un mutant à effet dominant négatif du TßRII (TßRII-KR) Etude systématique de la prolifération des CMLv en fonction de la densité cellulaire Effets du TGFß sur les récepteurs de type I de l’AngII (RAT1) Invivo Impact de l’invalidation de la voie de signalisation du TGFß dans les CMLs sur le développement embryonnaire

pM/min/µg de protéines Invitro Effets du TGFß sur la CMLv Marqueurs de différenciation Prolifération CML WT TßRII-KR contrôle TGFß TGFß 120 + TGFß1 1ng/ml - + - + 100 Actine α-SMA 43 KDa 80 Prolifération en (%) 60 40 Calponine 34 KDa 20 WT TßRII-KR Apoptose Protéines de la matrice extrcellulaire 1000 CML WT TßRII-KR 900 contrôle TGFß TGFß 800 + TGFß1 1ng/ml - + - + 700 pM/min/µg de protéines Activité caspase 3 600 Collagène I 140 KDa 500 400 300 200 Laminine I 200KDa 100 WT TßRII-KR

Nombre de cellules à J3 x 106/puits pM/min/µg de protéines Effet de la densité cellulaire sur le rôle du TGFß sur la prolifération des CMLv. 1.6 Contrôle 1.4 ** * *** + TGFß1 1ng/ml 1.2 Nombre de cellules à J3 x 106/puits 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Nombre de cellules à J0 x 106 Synthèse d’ADN Apoptose 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 * ** 0.8 ** * Contrôle 0.7 Contrôle + TGFß1 1ng/ml Incorporation de 3H thymidine Cpm/cellule + TGFß1 1ng/ml 0.6 pM/min/µg de protéines Activité caspase 3 0.5 0.4 0.3 0.2 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Nombre de cellules à J3 x106 Nombre de cellules à J3 x106 Effet biphasique du TGFß sur la prolifération des CMLv : Synthèse d’ADN constant Apoptose inversement corrélée à la densité

Effets du TGFß sur les récepteurs de type I de l’AngII (RAT1) Déplacement de l’ 125I-AngII par AngII froid 20 40 60 80 100 120 WT TßRII-KR - TGFß1 + TGFß1 1ng/ml Liaison de l’ 125I-AngII % 125I-AngII lié 500 1000 1500 2000 2500 3000 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 - TGFß1 + TGFß1 1ng/ml Log AngII froid (M) cpm125I-AngII lié/puits y = -0,0019x + 0,0035 y = -0,002x + 0,0019 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 - TGFß1 + TGFß1 1ng/ml AngII lié /AngII libre AngII lié en fmoles/puits Scatchard 20 40 60 80 100 contrôle TGFß1 1 ng/ml % RAT1 WT RT-PCR en temps reel Déterminer si l’effet du TGFß sur le récepteur RAT1 se situe au niveau transcriptionnel ou post transcriptionel ( stabilité)

Invivo L’impact de l’invalidation de la voie de signalisation du TGFß dans les CMLs TßRII Exon floxé TßRII E floxé : Jürgen ROES, Londres, Royaume-Uni : Stefan KARLSSON, Malmö, Suède 575 pb allèle floxé 422 pb allèle WT SM22 Cre constitutive : Denise PAULIN, Jussieu, Paris SM22-Cre constitutive SM22 TßRII CML SM22 Cré +/- X TßRII E floxé +/+ 300pb CML

Le génotype TßRII E floxé +/+ / SM22 Cré +/- est létal Résultats TßRII E floxé +/- / SM22 Cré+/- X TßRII floxé +/+ Pas de souris vivantes TBRII E floxé +/+ / SM22 Cré +/- Le génotype TßRII E floxé +/+ / SM22 Cré +/- est létal A quelle étape du développement se produit la mort des embryons? Récupération 92 fœtus entre 8,5 et 14,5 jours de gestation issus de croisements TßRII E floxé +/- / SM22 Cré+/- X TßRII E floxé +/+ Le nombre de fœtus avec le génotype TßRII E floxé +/+ / Cré +/- est normal La létalité se produit au cours du dernier tiers de la gestation

Perspectives Perspective I Comprendre la cause de létalité précoce des foetus où la voie du TGFß est invalidée -Analyse histologique des fœtus TßRII E floxé +/+ / SM22 Cre+/- afin de déterminer la cause de la létalité. -Vérification des tissus dans lesquels le promoteur SM22 est actif (lignée Rosa 26R -ßgal rapportrice de l’activité de la Cre). -Vérification par Southern blot de l’excision de l’exon floxé dans les différents tissus des souris TßRII E floxé +/+ / SM22 Cre+/-.

Perspective II Etudier l’impact de l’invalidation de TßRII sur la physiopathologie des CMLs à l’âge l’adulte Eviter la létalité au stade embryonnaire Nous disposons d’une lignée transgénique SMMHC-Cre inductible laboratoire de Stefan OFFERMANS, Université d’Heidelberg, Allemagne SMMHC-Cre 287 transgène SMMHC-Cre 225 allèle WT

SMMHC-Cré inductible X TßRII E floxé TßRII E floxé +/+ / SMMHC-Cre+/- SMMHC promoteur Cre ER-LBD* TßRII floxé E SMMHC-Cre HSP 90 Cre Sans Tamoxifène ER-LBD* E Pas d’Excision Tamoxifène 1mg/jour sur 5 jours HSP 90 ER-LBD* Cre ER-LBD* TßRII floxé E Excision TßRII excisé E

TßRII E+/+ / SMMHC-Cre+/- I- Etudier le rôle du TGFß sur : les paramétres cardiovasculaires le remodelage vasculaire le niveau d’activité du SAt dans la paroi vasculaire II- Approfondir les mecanismes d’interaction entre Ang II et TGFß Réponses a l’AngII des CMLv en culture Modulations pharmacologiques du système RAS invivo Perfusion: AngII (en aigu et chronique) Antagonistes de RAT1

III- Développement de l’athérosclérose - Par croisements, introduction du génotype LDLR-/- dans la lignée TßRII E+/+ / SMMHC-Cre+/- TßRII E+/+ / SMMHC-Cre+/- / LDLR-/- Développement de l’athérome Caractéristiques de la plaque athéromateuse

Plan du travail Première année Deuxième année Comprendre la cause de létalité précoce des foetus où la voie du TGFß est invalidée Etudes histopathologique Génération de nos modèles d’études de souris SMMHC-Cre+/- / TßRII E floxé+/+ SMMHC-Cre+/- / TßRII E floxé+/+ / LDLR-/- Deuxième année Exploration physiologique Etude structurale de la paroi artérielle

Environnement du projet EA 3740, Génomique fonctionelle de l’athérotrombose Analyse structurale de la paroi artérielle (normale et pathologique) Dr. BOURDILLON M. C Plate-forme ANIPHY Exploration physiologique du petit animal Etudes fonctionnelles de la pression artérielle, fréquence cardiaque Dr. BRICCA Giampiero Plate-forme Anipath Etudes histopathologique, Dr SCOAZEC Jean-Yves

Merci de votre attention

Pression artérielle fréquence cardiaque DEMARCHE EXPERIMENTALE 1 Contrôle SMMHC-CRE sans Tamoxifène SMMHC-CRE + Tamoxifène Ages (sem) 8 16 Pression artérielle fréquence cardiaque C I P P+AII IRBESARTAN 50mg/kg/24h PERINDOPRIL 3mg/kg/24h ANGIOTENSINE II 150 ng/kg/min

Sur les souris vivantes Protocole expérimental TßRII Exon 4 floxé Sur les souris vivantes 575 pb allèle floxé 422 pb allèle WT SMMHC-Cre 287 allèle SMMHC-Cre 225 allèle WT Sur les fœtus TßRII E floxé +/- /SM22 Cré +/- : De bolus d’ANG II pour voir les effets aigus de l’ang ii TßRII E floxé +/- X WT-/- TßRII E floxé +/- X TßRII E floxé+/-

Résultats 1°) Sur les souris vivantes (suite) -Un deuxième test c2 a été fait sur ces mêmes croisements en considérant qu’il n’y avait plus que 3 possibilités de génotypage au lieu de 4 (génotypage 1 est létal). (TßRII floxé +/+ / SM22 Cré +/- A1 = 0 ) TßRII floxé +/+ / SM22 Cré -/- A2 = 11 E2 = 18,33 TßRII floxé +/- / SM22 Cré +/- A3 = 13 E3 = 18,33 TßRII floxé +/- / SM22 Cré -/- A4 = 31 E4 = 18,33 total = 55 Dans ce cas là E=55/3=18,33 (A2=11 , A3=13, A4=31) -La statistique c2 que nous trouvons est de 13,23 avec 2 degrés de liberté (p=0,0010). Les résultats trouvés sont statistiquement différents des fréquences attendues. -Le génotype TßRII floxé +/- / SM22 Cré -/- semble être statistiquement sureprésenté.

Effet du TGFß sur l’apoptose des CMLv en fonction de la densité cellulaire à J3 Contrôle + TGFß1 1ng/ml 0.8 ** * 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Le TGFß exerce sur l’apoptose un effet stimulant inversement corrélé à la densité des cellules à J3. Le TGFß perd son effet apoptotique aux fortes densités cellulaires