La modulation de l’apoptose dépendante du récepteur Fas : Étude des événements précoces de la voie de signalisation apoptotique dans un modèle de lymphocytes T humains. Marie Bénéteau UMR CNRS 5164 Bordeaux Pr Jean-François Moreau Directeur de thèse : Jean-Luc Taupin Présentation Nice 08/03/07

Maladies auto-immunes (ALPS) Introduction : le récepteur Fas et sa voie de signalisation apoptotique FADD DISC Caspase 8 Apaf-1 Cytochrome c Apoptosome Caspase 9 Caspase 3 APOPTOSE Fas Itoh et al., Cell, 1991. Oehm et al., J Biol Chem, 1992. N C 1 66 112 149 214 298 317 CRD1 CRD2 CRD3 DM PLAD c-FLIPL c-FLIPS Voie de type II Voie de type I Mutations du gène Fas Maladies auto-immunes (ALPS) Cancers (lymphomes) D’après Bidère et al., Annul Rev Immunol, 2006

Implication des microdomaines dans le signal Fas Introduction : le récepteur Fas et les microdomaines membranaires Implication des microdomaines dans le signal Fas Muppidi et Siegel, Nature Immunol, 2004. Microdomaines : Zones compactes flottant dans la membrane plasmique Enrichies en certains lipides et protéines Legembre et al., Mol Cell Biol, 2005. Legembre et al., J Immunol, 2006. Voie de type I Voie de type II APOPTOSE

Problématique : Étude des événements précoces de la voie de signalisation apoptotique I II

De la résistance à l’anticorps agoniste et de l’implication de c-FLIP Dominant-negative Fas mutation is reversed by down-expression of c-FLIP. Cancer Res. 2007 Jan 1;67(1):108-15.

Constatation : différence anticorps agoniste et ligand de Fas FasL IgM anti-Fas 7C11 IgFasL Concentration (ng/ml) 20 40 60 80 100 0,1 1 10 1000 % cellules mortes Fas Cellule Jurkat Maximum d’apoptose 95% 100% 5% JKR#2 Sélection de cellules résistantes

I. 1. Sélection de cellules résistantes Sensibilité à différents activateurs de Fas 7C11 IgFasL JK77 100 100 JKR#2 80 80 60 60 % cellules mortes 40 40 20 20 100 200 300 400 100 200 300 400 Concentration (ng/ml) Concentration (ng/ml) Résistance aux anticorps agonistes. Sensibilité maintenue mais diminuée au FasL. Pas de modification de la quantité de Fas à la membrane. Pas de différence de quantité des protéines de la voie de signalisation apoptotique. Pas d’activation de la caspase 8 dans les Jurkat R traitées par le 7C11

I. 2. Analyse de la résistance 2.1. Séquence du récepteur Fas EAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKK a3 a4 a5 mutant DTAEQKVQLL normal DTAEKKVQLL Huang et al., Nature, 1996. Présence d’une mutation au statut hétérozygote dans le domaine de mort : Q257K

> Mutation responsable du phénomène de résistance. I. 2. Analyse de la résistance 2.2. Conséquences de la mutation Q257K Jurkat WR19L Splénocytes murins Méthode : transfection des WR19L Marquage Fas murin Cellules parent Nombre de cellules Nombre de cellules contrôle Fas FasQ257K Anti-Fas Isotype Marquage Fas humain Transfection WR19L Intensité de fluorescence 200 400 7C11 20 40 60 80 100 WR19L sFasL 50 150 Concentration (ng/ml) % cellules mortes WR19L Fas WR19L FasQ257K Dans un contexte homozygote, le Fas Q257K ne transmet aucun signal apoptotique. Dans un contexte hétérozygote, résistance à l’apoptose plus marquée avec l’anticorps qu’avec FasL et selon le niveau d’expression de la forme mutée. > Mutation responsable du phénomène de résistance.

Hypothèse : seuil de sensibilité Normal 7C11 Mutant c-FLIP Fas FADD Caspase 8 Apoptose Apoptose Apoptose ARN interférent

II. 3. Restauration de la sensibilité Inhibition de c-FLIP : analyse de la sensibilité à l’apoptose Méthode : ARN interférent Jurkat-R/ ARNi FLIP #1 Jurkat-R/ ARNi FLIP #2 Jurkat-R/ ARNi contrôle Transfection stable 7C11 20 40 60 80 100 200 300 400 Concentration (ng/ml) % ADN fragmenté 100 C ARNi Jurkat-R FLIPL - Casp-8 FLIPs - L’inhibition de c-FLIP restaure la sensibilité à l’apoptose. (restaure l’activation des caspases et la formation du DISC)

Conclusion et perspectives (I) : Différences entre anticorps agoniste et FasL Seuil d’activation du récepteur Fas Agrégation versus conformation Normal Mutant 7C11 Agrégation nécessaire : - Anticorps agoniste IgM ou IgG3 - FasL soluble multimérique Conformation importante : Anticorps agoniste ne joue pas sur la conformation. Implication dans la physio-pathologie des ALPS : Syndrome multi-factoriel Perspectives : Sensibilisation par d’autres molécules ? Ex. : banques de molécules chimiques Accessibilité de c-FLIP au DISC ? Immunoprécipitation - ultracentrifugation sur gradient de saccharose - microscopie à fluorescence

De la relocalisation de Fas dans les II. De la relocalisation de Fas dans les microdomaines par l’inhibition de la PI3K

? Le récepteur Fas et la voie PI3K 1. 2. Edelfosine Gajate et Mollinedo, Blood, 2001. Edelfosine L’édelfosine induit un signal de mort dépendant de Fas et impliquant les microdomaines. 1. PIP3 PIP2 AKT p85 p110 PI3K P Voie PI3K LY294002 Wortmannine P-Akt Akt - + - + 2. Edelfosine - + L’édelfosine est un inhibiteur de la PI3K. Question : L’inhibition de la PI3K induit la relocalisation de Fas dans les microdomaines ? Apoptose induite par inhibition de la PI3K (LY294002 et wortmannine) Localisation de Fas par rapport aux microdomaines ?

II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K Spécificité de l’inhibition CEM Jurkat H9 (Type I) Type II Edelfosine 20 40 60 80 100 2 4 6 8 10 12 (µg/ml) LY294002 120 30 50 % cellules mortes (µM) 70 concentration Type II Type I CEM JK H9 P-Akt Akt L’inhibition de la PI3K conduit à la mort cellulaire, préférentiellement dans les cellules de type II.

concentration (ng/ml) II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K Analyse de la sensibilité de cellules déficientes en Fas 20 40 60 10 LY294002 Wortmannine 30 % ADN fragmenté Concentration (µM) Isotype Fas CEM IRC Intensité de fluorescence Nombre de cellules LY294002 20 40 60 Wortmannine 5 10 15 Jurkat FasQ257K Jurkat 25 concentration (µM) % Cellules mortes sFasL 20 40 60 80 100 concentration (ng/ml) % cellules mortes CEM CEM IRC Le signal de mort nécessite une voie Fas fonctionnelle.

II. 1. Apoptose induite par inhibition de la PI3K Analyse de l’interaction entre Fas et FasL Méthode : anticorps bloquants Contrôle Anti-FasL 20 40 60 80 100 % cellules mortes sFasL 20 40 60 80 100 120 Contrôle Anti-Fas sFasL Edelfosine LY294002 Le signal de mort est indépendant : - de l’expression de FasL - de l’interaction entre Fas et FasL.

Hypothèse : l’inhibition de la PI3K permet la relocalisation de Fas dans les microdomaines Méthode : Immunofluorescence Edelfosine LY294002 Wortmannine Anticorps anti-Fas AlexaRed PIP3 PIP2 AKT p85 p110 PI3K P CTX-FITC

II. 2. Localisation de Fas et des microdomaines Superposition IECB F De Giorgi et F Ichas Contrôle Edelfosine LY294002 Wortmannine Technique : Linescann Intensité de fluorescence Distance (unités arbitraires) L’inhibition de la PI3K induit la colocalisation de Fas et des microdomaines.

Activation de la transcription Conclusion (II) : Edelfosine LY294002, Wortmannine Restimulation TCR 1 PI3K Voie de type II 2 Voie de type I Activation de la transcription APOPTOSE

Perspectives Fas Ezrine Actine 1. Inhibition spécifique de la PI3K ? - Utilisation de formes inhibitrices de la p85 (cellules de type II) - Utilisation de formes constitutivement actives de la p110 (cellules de type I) 2. Implication de l’ezrine comme adaptateur entre Fas et actine : Utilisation de formes tronquées de l’ezrine Mise en évidence du domaine de liaison à l’ezrine dans le récepteur Fas. Actine Fas Ezrine

Des agrégats de haut poids moléculaire du récepteur Fas Journal of Immunology, 2003 Cutting Edge: SDS-Stable Fas Microaggregates: An Early Event of Fas Activation Occurring with Agonistic Anti-Fas Antibody but Not with Fas Ligand Patrick Legembre, Marie Beneteau, Sophie Daburon, Jean-François Moreau, and Jean-Luc Taupin.

Les agrégats de Fas JK 77 + anticorps agoniste Constatation : présence de formes de haut poids moléculaire de Fas. JK 77 + anticorps agoniste C 0 15  30 60 90 120 180 Temps (minutes) Agrégats Fas 250 50 Monomère Fas Caractéristiques : - résistants aux SDS et au b-mercapto-éthanol, - résistants à la dénaturation thermique.

? Questions : 1. Apparition avec le FasL ? 2. Corrélation à l’apoptose ? 3. Limitation aux cellules Jurkat ? ?

1. Dans les cellules Jurkat stimulées par différents activateurs Les agrégats de Fas 1. Dans les cellules Jurkat stimulées par différents activateurs C 7C11 C IgFasL C 1A12 Temps (h) 3 0,25 0,5 1 1,5 2 3 3 0,25 0,5 1 1,5 2 3 6 0,5 1,5 3 4,5 6 250 50 % apoptose L’apparition des agrégats de Fas : - est due à l’anticorps agoniste - n’est pas indispensable à l’apoptose.

Les agrégats de Fas CEM SKW6.4 H9 2. Dans plusieurs lignées lymphocytaires 7C11 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5 250 50 Temps (h) C IgFasL 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5 % apoptose CEM SKW6.4 H9 Type II Type I Observation du même phénomène quelque soit les lignées testées.

Les agrégats de Fas 3. Dans les lymphocytes sanguins IgFasL 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5 Temps (h) 5 0,5 2 5 0 0,5 2 5 % apoptose Lymphocytes non activés Activés Dans les lymphocytes, les agrégats apparaissent de la même manière et ne sont pas corrélés avec l’apoptose.

Conclusion La formation des agrégats de Fas résistants au SDS dans la lignée cellulaire Jurkat est induite par l’anticorps agoniste mais pas par le FasL, qu’il soit sous forme soluble ou membranaire. Les mêmes résultats sont obtenus avec plusieurs lignées lymphocytaires et les lymphocytes sanguins. L’anticorps agoniste et le FasL fonctionnent différemment.

Lymphocytes et PI3K Analyse de la voie PI3K au cours de l’activation Restimulation Type II Type I P-Akt Akt 1 2 3 4 5 Temps (jours) Isolement PHA IL2 Restimulation du TCR

Lymphocytes et PI3K Analyse de la voie PI3K au cours de la restimulation 10 20 30 C CD3 % ADN fragmenté Anti-CD3 C P-Akt Akt 0 6 0,5 1 3 6 h 0,2 0,4 0,6 0,8 1 2 4 6 Incubation (heures) ratio P-AKT/AKT La restimulation du TCR inhibe la voie PI3K.