Physiologie et exploration de l’hémostase 11/10/11-P2 2e partie Annie Bezeaud, Faculté Médecine Université D. Diderot – Paris7 Lectures conseillées: Poly d’hémostase P2:il y a TOUT Abrégé d’Hématologie (Masson) ed 2008 Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Mots cles médecine générale Embolie pulmonaire thrombose réanimation obstétrique maladies du foie aspirine cardiologie AVC infarctus hémophile anticoagulants phlébite Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot IV- L’initiation de la coagulation Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

FT FT Facteur tissulaire (FT): 1- co-facteur de l’auto-activation du FVII par le FVIIa VII VIIa SP SP EGF2 Dans le sang: FVII (pro-enzyme) + traces de FVIIa (inactif en absence de FT. FT EGF2 FT EGF1 EGF1 Gla Gla Ca++ Ca++ Phosphatidylsérine (PS) Fibroblaste Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

FT Facteur tissulaire (FT): 2- co-facteur de l’activation du FIX et du FX par le FVIIa FIXa, FXa FVIIa SP FIX, FX EGF2 SP EGF2 EGF1 EGF1 La liaison Ca++ et Gla dépendante entre VIIa, IX, X et Phospholipides (-) est indispensable à l’activation du IX et du X. Gla Gla Ca++ Ca++ Phosphatidylsérine (PS) FT Fibroblaste Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Hémostase = obstruction d’une brèche vasculaire Fibroblaste Adventice FT Media VIIa FW IX IXa VIIIa X II Va Xa Fibrine IIa Fibrinogène Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot A retenir: IV- L’initiation de la coagulation La coagulation est initiée lorsque une protéine membranaire, le Facteur tissulaire (adventice, epithelium) vient au contact du sang (blessure vasculaire) Inséré dans la bicouche de phospholipides membranaires, il interagit avec le VII/VIIa = auto-activation du VII activation du IX et du X par le VIIa Pathologie: l’expression du FT peut être induite par les médiateurs de l’inflammation dans des cellules circulantes (monocytes) ou Vasculaires (cellules endothéliales, cellules musculaires lisses) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot V- La propagation et l’amplification de la coagulation Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Amplification de la coagulation Les 1ères traces de thrombine: activent les co-facteurs (FV et FVIII) recrutent et activent de nouvelles plaquettes activent le FXI Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Fibroblaste Adventice FT Sous-endothelium F.Willebrand VIIa VII KHPM XIIa XII KHPM IX XIa XI PK K IX IXa IXa La thrombine amplifie sa formation VIIIa VIIIa X X Xa VIII Va XIa Xa II Va XI II V Thrombine PAR Plaquette Fibrine stabilisée Fibrinogène Fibrine XIII XIIIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot IXa Complexe tenase VIIIa X Xa II Complexe prothrombinase Va Xa IIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot A retenir: V- La propagation et l’amplification de la coagulation Les réactions enzymatiques de la coagulation (réactions protéolytiques) se propagent à la surface des plaquettes amarrées à la brèche vasculaire Grâce à la fixation des facteurs vitamine K-dépendants à la phosphatidylsérine externalisée par les plaquettes activées Les 1ères traces de thrombine formées amplifient les réactions: Activation des co-facteurs (FV et FVIII) et formation des complexes tenase et prothombinase (conditions cinétiques optimales) Recrutement et activation de nouvelles plaquettes (surface catalytique + grande) Activation du FXI voie alterne de production de thrombine Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot VI- Les multiples fonctions de la thrombine Auto-amplification de sa production par activation des co-facteurs (FV, FVIII) et du FXI. Conversion du fibrinogène en fibrine Activation cellulaire Rôle dans la régulation de la coagulation (systeme de la protéine C) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Conversion du fibrinogène en fibrine 1. Protéolyse du fibrinogène par la thrombine Fibrinogène Fibrine A a A a a a B b B b b b g g g g Thrombine + fibrinopeptides A et B Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Conversion du fibrinogène en fibrine 2. Polymérisation des monomères de fibrine a GPR b GHR g g g g b b a a Liaison hydrogène Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Conversion du fibrinogène en fibrine 3. Stabilisation de la fibrine GPR RPG GHR RHG g g b b a a Ca++ Ca++ XIIIa XIII Liaison covalente Thrombine Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot A retenir: Conversion du fibrinogène en fibrine La thrombine scinde 2 FpA et 2 FpB des chaînes Aa et Bb respectivement, convertissant le fibrinogène en monomère de fibrine soluble Le clivage des Fp démasque des sites de polymérisation qui permettent d’établir des liaisons hydrogène entre monomères: polymère de fibrine solide mais instable Association de monomères bout à bout (longitudinale) puis latérale: épaissisement des fibres Parallèlement, la thrombine active le FXIII par protéolyse des sous-unités a. Le démasquage du site actif du XIIIa nécessite le Ca2+ et la fibrine. Fixé à l’extrémité C-ter des chaînes a, le XIIIa établit des liaisons covalentes entre une Gln (donneur) et une Lys (accepteur) des chaînes a et des chaînes g: polymère de fibrine solide et stable Fp: fibrinopeptide (A:18 aa, B:16aa) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot VI- Le système du contact ( ou voie endogène) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Fibroblaste Adventice FT Sous-endothelium F.Willebrand VIIa VII KHPM XIIa XII KHPM IX XIa XI PK K IX IXa IXa VIIIa VIIIa X X Xa VIII Va XIa Xa II Va XI II V Thrombine PAR Plaquette Fibrine stabilisée Fibrinogène Fibrine XIII XIIIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Sous-endothelium FW KHPM XIIa XII KHPM IX Activation de XIa XI K PK la coagulation IXa Fibrinogène VIIIa X Xa Activation du Activation de Va complément la fibrinolyse II Pg Pe Thrombine PK K scuPA tcuPA BK KHPM bradykinine Production de substances Sous-endothelium vaso-actives Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot VII- Le contrôle de la coagulation Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot La coagulation est sous le contrôle de l’endothélium Fibroblaste Adventice FT Media VIIa FW IX VIIIa Flux IXa II X Va Xa Fibrine IIa Fibrinogène AT AT TFPI GAGs GAGs TM PC Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot EPCR propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

-e-Les inhibiteurs plasmatiques Antithrombine (AT) Synthétisée par le foie, « activée » par la liaison aux glycosaminoglycanes de la paroi vasculaire ou à l’héparine les autres serpines: Cofacteur II de l’Héparine, alpha 1 Anti Trypsine Système de la Protéine C - protéine C zymogène produit par l’hépatocyte - protéine S cofacteur produit par l’hépatocyte et la cellule endothéliale - 2 récepteurs: Thrombomoduline et EPCR ( endothelial protein C receptor) TFPI ( tissue factor pathway inhibitor ) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot L’Antithrombine est une serpine activée par l’héparane Sulfate des cellules endothéliales vWF IXa VIIIa AT X II AT Va Xa Fibrine Xa Xa AT AT is a major direct thrombin inhibitor It belongs to the Serpin family for serine protease inhibitor AT slowly neutralizes proteases of the coagulation cascade through the formation of a stochiometric complex with IIa Xa, or Ixa . This results in an irreversible protease inhibition The inhibitory effect of AT is 1000 fold increased by binding to Heparan sulfate or other related GAGs (and heparin) by binding to the « high affinity site . Regulation of HS in veins and arteries ???? thrombine Fibrinogene IXa thrombine AT AT AT AT Heparane sulfate Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Héparine et interaction Antithrombine (AT) / protéases -A- -B- AT AT AT IIa Xa Xa HBPM HNF HNF Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Le système de la PC, activé à la surface de l’endothélium, régule les co-facteurs Va et VIIIa La liaison de la thrombine à la thrombomoduline (TM) supprime ses activités pro-coagulantes. Le complexe thrombine/TM active la Protéine C (PC), liée à la TM et à son récepteur endothélial (EPCR). La PC activée (PCa) dégrade les FVa et FVIIIa, en présence de protéine S (PS), sur la surface des plaquettes activées. Les FVi et FVIIIi n’ont plus d’activité co-facteur. VIIIi Vi (2b) (2a) TM IIa PCa (1) VIIIa PCa Va PS PS PCa PC EPCR Endothelium FW FW Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Régulation de la coagulation par le TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) FT FT TFPI Xa VIIa VIIa IX IXa VIIIa Xa TFPI X Va Xa Ca ++ II Thrombine TFPI Glycosaminoglycanes Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot TFPI-2

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot A retenir: Régulation négative de la coagulation L’antithrombine est une serpine (inhibiteur de sérine protéases) dont l’activité est potentialisée par l’héparane sulfate des parois vasculaires. Elle forme des complexes irréversibles inactifs avec la thrombine, le FXa, les FIXa et XIa, lorsque ceux-ci ne sont pas fixés sur les surfaces membranaires. Système de la protéine C: 2 protéines membranaires endothéliales (thrombomoduline et EPCR) potentialisent l’activation de la protéine C par la thrombine. La protéine C activée (avec son co-facteur la protéine S) dégrade les co-facteurs Va et VIIIa, et ralentit la production de thrombine. Le TFPI, fixé sur les glycosaminoglycanes de la paroi vasculaire, forme un complexe avec le FXa. Le complexe FXa-TFPI se fixe sur le complexe FT-FVIIa et bloque l’initiation de la coagulation par le facteur tissulaire (FT). Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot VIII- La fibrinolyse Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Fibrinolyse: Les intervenants 1- Une surface : le réseau de fibrine 2- Les protéines plasmatiques: - Activateurs Plasminogène: synthèse hépatique, zymogène de sérine protéase ( plasmine) tPA: serine protéase, principalement synthétisée par la cellule endothéliale (CE) ProUrokinase-Urokinase: sécrétée sous forme inactive (pro-uPA) par de nombreuses cellules. Pour qu’uPA soit active, le pro-uPA doit se lier à son récepteur membranaire spécifique: uPAR. intervient alors dans les processus de dégradation de la matrice extracellulaire en activant des métalloprotéases. - Inhibiteurs PAI1: serpine, produite par la CE, le foie : inactive tPA et UPA α2 antiplasmine: synthetisée par le foie TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor):élimine les résidus lysine qui permettent à la fibrine d'être reconnue par le plasminogène ou la plasmine. Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Le système plasminogène-plasmine Digestion de la fibrine (1) PAI-1 tPA Fibrine Pg tPA Plasmine PAI-1 PAI-1 tPA PDF solubles Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Le système plasminogène-plasmine Digestion de la fibrine (2) tPA Pg Fibrine Pn PDF solubles a2-antiplasmine (Foie) TAFI ( Foie) (pro-carboxypeptidase B) Contrôle: PAI-1 Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot A retenir: Système plasminogène-plasmine Le plasminogène (Pg) et son activateur plasmatique (tPA) se fixent sur la fibrine. Cette fixation protège le tPA de son inhibiteur (PAI-1) = le tPA active le Pg et la plasmine produite solubilise la fibrine (fibrinolyse) Dans la paroi du vaisseau, le Pg et ses activateurs (uPA et tPA) se fixent sur des récepteurs cellulaires (cellule endothéliale, cellule musculaire lisse). Cette fixation protège l’uPA et le tPA de leurs inhibiteurs (PAI-1, PN-1) = le Pg est transformé en plasmine qui active des métalloprotéases et des facteurs de croissance (remodelage vasculaire) Le système est régulé négativement par le PAI-1 et l’a2- antiplasmine qui forment des complexes irréversibles inactifs avec le tPA ou uPA, et la plasmine, respectivement, lorsque les enzymes diffusent à distance de la fibrine. Le TAFI, activé par la thrombine, hydrolyse le Pg et l’empêche de se fixer à la fibrine. Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Exploration de l’hémostase Des tests qui explorent: L’hémostase primaire : temps de saignement temps d’occlusion plaquettaire La coagulation plasmatique : tests globaux temps de Quick (TQ) temps de céphaline+activateur ( TCA) dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Exploration de l’hémostase Des tests qui explorent: L’hémostase primaire : temps de saignement temps d’occlusion plaquettaire La coagulation plasmatique : tests globaux temps de Quick (TQ) temps de céphaline+activateur ( TCA) dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Temps de saignement - Méthode d'Ivy-incision N < 10 min F.Willebrand / collagène - Explore : . nombre et qualité des Fibrinogène plaquettes ADP . F.Willebrand, fibrinogène TxA2 . qualité du vaisseau - Fonction de l'hématocrite - Limites : . valeur prédictive du saignement médiocre . reproductibilité imparfaite, opérateur dépendant . sensibilité limitée . fiabilité faible en cas d'anomalie cutanée Alternative: analyseur des fonctions plaquettaires (PFA) sur un prélèvement sanguin Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Temps d’occlusion plaquettaire PFA-100 (Dade-Behring) Le sang du patient prélevé sur anticoagulant est analysé sur la machine, passage sur 2 cartouches Collagène+adrénaline et Collagène+ADP http://fmc.med.univ-tours.fr/Pages/Hemato/DES/B36.pdf -détermine le temps compris entre le début du test et l’obstruction complète par les plaquettes = TO temps d’occlusion en secondes. Explore : Nombre et qualité des Plaquettes F.Willebrand, fibrinogène Limites: thrombopénie, hématocrite bas Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Exploration de l’hémostase Des tests qui explorent: L’hémostase primaire : temps de saignement temps d’occlusion plaquettaire La coagulation plasmatique : tests globaux temps de Quick (TQ) temps de céphaline+activateur ( TCA) dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Sur un chélateur du calcium (citrate par exemple) Le sang est prélevé Sur un chélateur du calcium (citrate par exemple) Afin de bloquer la coagulation 1 2 Le tube de sang est centrifugé à 2500g Pendant 10 minutes x 2 fois Le plasma est conservé pour réaliser les tests; il ne contient ni plaquettes, ni phospholipides et le Ca2+ est bloqué Pour initier la coagulation, il faudra ajouter - du Ca2+, et des phospholipides - Puis - soit du FT (TQ) pour activer le F.VIIa - soit « un contact (TCA)-kaolin, silice etc… 3 Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot 4

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Pour réaliser un test, il faut initier la coagulation, donc ajouter ce qui manque: du Ca2+, et des phospholipides (surfaces plaquettes) Puis - soit pour réaliser un TQ : du FT pour activer le F.VII du plasma. - soit pour réaliser un TCA : « un contact: kaolin, silice etc… tube Automate d’hémostase Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Mode de calcul du temps de Quick (TQ) Etalonnage à partir d’un pool de plasma normal. Mesure du temps du pool pour chaque dilution 50% > TQ du Pool au 1/2 33 % > TQ du Pool au 1/3 25 % > TQ du Pool au ¼ régression semi Log Mesure de l’échantillon inconnu: on porte le temps sur la droite et on en déduit un % Ici: temps de Quick: 20 sec Correspond à 40% sur la droite Normale TQ> 70% 20’’ 40% Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot + PL FT VIIa VII KHPM XIIa XII KHPM IX IX XIa XI PK K Ajout de quantités tres importantes de FT IXa IXa VIIIa VIIIa X X Xa VIII Va XIa Xa TQ II Va XI II V Thrombine PAR Plaquette Fibrine stabilisée Fibrinogène Fibrine XIII XIIIa Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Temps de Quick ( TQ) C’est un temps ( en s) il est exprimé en % de la normale N > 70 % Thromboplastine = phospholipides + facteur tissulaire Ca++ X VIIa VII Xa Voie Va exogène II Thrombine Fibrinogène Fibrine INR: réservé au TQ sous AVK Tronc commun Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Temps de céphaline + activateur (TCA) Exprimé en secondes: N< T+6 à 8 sec Ou en ratio P/T <= 1.2 Céphaline: phospholipides Activateur + Ca++ F. XII, KHPM, PK IX XI XIa VIIIa X IXa Voie endogène Xa Va II Thrombine Fibrinogène Fibrine Tronc commun Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot Exploration de l’hémostase Des tests qui explorent: L’hémostase primaire : temps de saignement temps d’occlusion plaquettaire La coagulation plasmatique : tests globaux temps de Quick (TQ) temps de céphaline+activateur ( TCA) dosages fonctionnels spécifiques Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot propriété Faculté de Medecine P7-Denis Diderot

Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot - Tous les facteurs de la coagulation se mesurent séparément - Leur taux est exprimé en % de la normale Exemple: dosage de F. X, ou F.VII etc… - Le dosage est un dosage fonctionnel: le résultat s’exprime en % ( N> 70%) - En cas d’anomalie, on peut envisager des explorations spécialisées ( dosage de l’Antigène par exemple) Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot

Très Important Apprenez sur votre poly Pour les passionnés: contacts Annie Bezeaud Bichat-poste 58 520 Ne lisez pas les vieilleries !!! Propriété de la Faculté de Médecine Paris7-Denis Diderot