Specific Targeted Research or Innovation Project SyntheGeneDelivery Ex vivo gene delivery for stem cells of clinical interests using synthetic processes of cellular and nuclear import and targeted chromosomal integration SyntheGeneDelivery 2006-2008

LEPG 2.4 M €

Vecteurs synthétiques : SyntheGene Transfert Equipe Edward Smith (Suède) Bioplexe (PNA ciblage au noyau) Equipe Yves Bigot (France) Vecteur d’intégration site spécifique Equipe Bruno Pitard (France) Vecteur d’administration Lipoplexe-Block copolymère Equipe Dominique Wells (Angleterre) Equipe Ronald Chalmers (Angleterre) Transfection ex vivo de cellules souches dans un cadre de thérapie génique

Safety is our leitmotiv… SyntheGeneDelivery Non-viral systems for ex-vivo gene transfer Transposon-based system Improved to bypass the biological barriers of the cell Site directed gene integration Safety is our leitmotiv…

Transposon-based system : SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner Mos1 Transposase gene 5’ITR 3’ITR ?

Mos1 Mariner

Mos1 ADN de 1286 pb TA ITR de 28 pb 4 différences entre ITR5’ et ITR3’ UTR5’ UTR3’ ORF Transposase TA ITR de 28 pb 4 différences entre ITR5’ et ITR3’ Gène sans intron codant la Tnp (345 acides aminés) Autonome

Mos1 ATG ORF Transposase Transcription du gène codant la Tnp ? polyA ITR5’ ITR3’ UTR5’ UTR3’ ORF Transposase TA ATG polyA

Mos1 ORF Transposase Transcription du gène codant la Tnp ? polyA ITR5’ ITR3’ UTR5’ UTR3’ ORF Transposase TA polyA ITR Mos1 mRNA Petit et al. 2006

Domaine de liaison à l’ADN Mos1 Traduction du messager codant la Tnp ? HTH D D 34 D   1 345 Domaine de liaison à l’ADN 3-D non connue Domaine Catalytique 3-D connue MgCl2 ou MnCl2 Hélice  Feuillet  Richardson et al. 2006 La Tpase est nécessaire et suffisante pour la transposition

Famille des protéines HTH Homodimère Qu’est ce que l’on sait sur HTH et ITR palindrome mirror Site symétrique ITR Liaison Courbure CRO, CRP,  répresseur Famille des protéines HTH Homodimère Hardwidge et al., 2002 3

? Méthode aléatoire Capacité de courbure In silico data http://hydra.icgeb.trieste.it/dna/bend_it.html ITR seul ITR + Tnp 1 2 3 4 5 6 Free probe Probes SEC2 SEC1 Permutation circulaire Courbé rigide Point de flexibilité mirror palindrome ITR5’= ITR3’ Angle 90° En règle générale les homodimères se fixent de façon symétrique sur les séquences paliindromiques ex CRO mais pour le répresseur de lambda ((transcription facteur GAL4 ou PPR1 ou HAP1))ce n’est pas le cas (Sarai 1989) et montré par cristallographie où les AA en contact avec les deux demi sites sont différents et par des études de substitutrions de bases en mesurant les énérgies libres (deltadeltaG). Mais ce n’est pas la séquence primaire qui est cause de cette asymétrie ce serait un encombrement stérique due à la liaison de la partie N terminale. Lambda se fixe sur du straight DNA ce n’est pas la conformation qui change la spécificité. Lambda et Cro ont une reconnaissance par lecture de la séquence (readout reconnaissance des bases) Indirect readout reconnaissance du backbone phosphate 3 points important pour La reconnaissance 1-Déformation de l’ADN (important pour EcoRV et BamHI 2-Coopérativité 3-Effet quantitatif d’une séquence spécifique ou non Les différences ne sont pas dues à la géométrie de la cassure mais plutôt à l’énergie mise en cause pour obtenir cette cassure (CAP Lawson 2004). Le point déterminant dans la géométrie locale de l’ADN serait les interaction Prot/ADN plutôt que la séquence seule. Augé gouillou 2005 MCB les deux demisites garde une activité de fixation de la tnp de 3% en EMSA Bigot 2005 sur l’ADN nu du 3’ ona un angle de 20° Fixation asymétrique du dimère de transposase 1/2 site différent ? Fonctionnement de la transposition 6

Qu’est ce que l’on sait sur le comportement de Mos1 83 kDa 160 kDa kDa 225 100 150 75 WT (1-345) 0 5 15 30 60 C minutes MONOMERE  dimère HTH D D 34 D   cis-dimérisation monomère / dimère

Mos1: mécanisme de transposition D 34 D D D D 34 D HTH TA 5’-TCAGGTGTACAAGTATGAAATGTCGTTT-3’ 3’-AGTCCACATGTTCATACTTTACAGCAAA-5’ Et après ??

Mos1: mécanisme de transposition Liaison à l’ADN Complexe synaptique Excision Insertion TA Vecteur ?? « Exciser - réinsérer » « Couper - coller »

Mos1: mécanisme de transposition Interaction Tnp/ITR Augé-Gouillou et al. 2001 ITR3’ > ITR5’ Impact sur la transposition ? Mécanisme améliorable ?? Mécanisme régulé ??

Mos1: mécanisme de transposition Test de transposition en bactéries. Tnpi Plasmide source de Tnp Production inductible Promoteur « tagging » : Apparition de clones tétra R = Evénements de transposition F = Nb bact Tet R / Nb total bact Induction sans Tnp avec Tnp 5Tet3 3Tet3 10-4 Pseudo-Mos1 Plasmide donneur de transposon 3Tet3 versus 5Tet3 Tétracycline sensible avant transposition

Mécanisme améliorable Transposition efficiency Mos1: régulations Mécanisme régulé Mécanisme améliorable + Tnp 5Tet3 3Tet3 10-4 Transgene size (bp) Transposition efficiency 372 10-3 1 200 10-4 2 500 1.2 10-4 5 000 5 10-6 7 000 3.6 10-8 13 000 < 10-9 Régulation ? Temperature (°C) 25 28 32 37 Transposition frequency 10-7 10-4 10-5 10-6 10-2 10-3

Mécanisme améliorable Mos1: régulations Mécanisme régulé Mécanisme améliorable Régulation ? Tnp protéine eucaryote. Modifications post-traductionnelles ? Fréquence de transposition in vitro minutes Tnp déP Tnp P ITR3’ Tnp P Tnp déP

Mos1: vecteur de demain… Transposon Ubiquiste Simple Améliorable Vecteur !! SyntheGeneDelivery

Transposon-based system : SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner Mos1 Transposase gene 5’ITR 3’ITR Chromosome

Transposon-based system : SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner mos1 Transposase gene 5’ITR 3’ITR

Transposon-based system : SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner mos1 Transposase gene 5’ITR 3’ITR Simple and small DNA molecule (1300 bp) Active in different cell types

SyntheGeneDelivery Transposon-based system : Mariner mos1 Transgene 5’ITR 3’ITR Transposase supplied in trans Plasmid mRNA Protein Transgène = gène médicament / thérapie cellulaire

2 - Enter into the nucleus SyntheGeneDelivery Ex vivo 3 - Enter into the chromosome 1 - Enter into the cell 2 - Enter into the nucleus + Transposase All synthetic, non-viral components

SyntheGeneDelivery: 1- To enter into the cell ev-Synthetic gene delivery systems + Transposase BGTC-Dope

In Cell Art (Bruno Pitard) SyntheGeneDelivery: 1- To enter into the cell ev-Synthetic gene delivery systems In Cell Art (Bruno Pitard) FDA Stem cells Lipoplexes BGTC-Dope no yes Block copolymers yes yes

Bypass the nuclear membrane: NLS LEPG - Tours (Yves Bigot) SyntheGeneDelivery: 2- To enter into the nucleus Bypass the nuclear membrane: NLS + Transposase SV40 NLS: on plasmids backbone DNA-NLS LEPG - Tours (Yves Bigot)

SyntheGeneDelivery: 2- To enter into the nucleus Bypass the nuclear membrane: NLS + Transposase Bioplex (PNA + NLS): coupled to plasmids backbone NLS Avaris AB (Elisabeth Törnquist) Karolinska Institutet (Edvard Smith)

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome + Transposase

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome + Transposase

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome + Transposase

Improve mos1 efficiency SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 efficiency Oxford Univ (Ronald Chalmers) LEPG -Tours (Yves Bigot)

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency TEST: Transfection of human cells (HeLa) Transfection: J1 Composition des complexes transfectés : - un plasmide donneur de transposon (néo) - un plasmide donneur de transposase (+/-) - un agent transfectant (PEI) J3 boîte de pétri Sélection en G418 15 jours Analyse des clones résistants à la Néo

Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Fischer et al. 2001

Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Wu et al. 2006

Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Himar in vitro Himar en cellules humaines Keravala et al. 2006

Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Transfection of human cells Pas de Tnp = pas de transposition Régulation négative de la production de Tnp MOS1 ? Petit et al. 2006 Induction RNAi ?

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector Mutagenesis to obtain hyperactive and/or non-phosphorylable MOS1 Tnp X 36 X 24 X 14 X 3 X 17 X 87 X 15 X 8 X 21 X 61 X 11 Transposition en bactérie

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector Mutagenesis to obtain hyperactive transposon sequence 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 49 51 53 55 57 59 61 63 GC content (%) Transposition frequency 3T3

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector Mutagenesis to obtain hyperactive transposon sequence (ITR/UTR) Transgene Transposition efficiency 3Tet3 1 5Tet3 0,03 3Tet33 16 33Tet55 6,2 33Tet33 6

SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Engineering the transposase and the vector Transgene Transposition efficiency 3Tet3 1 5Tet3 0,03 3Tet33 16 33Tet55 6,2 33Tet33 6 + Tnp hyperactive (X 80) Amélioration d’un facteur ± 1200

Improve mos1 transposition efficiency SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion Insertion aléatoire : qualité des cellules obtenues ? Essais de Fisher avec les « enfants bulle » Leucémies… Program the integration site using the DNA binding specificity of a defined ZFD fused to the transposase.

Improve mos1 transposition efficiency SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion ZFD fused Tnp Principe : Zing Finger Domain 30 AA Structurés par un Zn Liaison spécifique triplet AcNucl

Improve mos1 transposition efficiency SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion ZFD fused Tnp Principe : Zing Finger Domain 30 AA Structurés par un Zn Liaison spécifique triplet AcNucl

Improve mos1 transposition efficiency SyntheGeneDelivery: 3- To enter into the chromosome Improve mos1 transposition efficiency Target the insertion ZFD fused Tnp 4 x 3 pb = 12 pb. Séquence unique. Choix de la séquence « cible » pour l’intégration du transgène: 12 pb. Fabrication du ZBS correspondant / fusion avec la Tnp MOS1. Ciblage de l’intégration

Imperial College (Dominic Wells) SyntheGeneDelivery: 4- Transformation of stem cells Mesenchymal stem cells (hfMSC) First trimester fetal blood - multipotentiality (differentiation) Therapeutic potential in utero transplantation Mesenchymal deficiency diseases Muscle stem cells Genetic muscle disorder Intramuscular graft = Factory cells Imperial College (Dominic Wells)

SyntheGeneDelivery Analyses of transposition events Un événement de transposition « vraie » par cellule. Pas de recombinaison (présence trop ADN ou Tnp) Disparition du plasmide donneur de transposon. Disparition de la source de Tnp. Localisation de l’intégration. Southern blots = Choix des « bonnes » cellules

Analyses of transposition events SyntheGeneDelivery Analyses of transposition events

Analyses of transposition events SyntheGeneDelivery Analyses of transposition events Liu et al. 2005 Transposition = 1 bande TA au séquençage

Avoiding recombination SyntheGeneDelivery Avoiding recombination Insertion d’un gène suicide dans le plasmide donneur de transgène et apport de la transposase sous forme d’ARNm

Avoiding recombination SyntheGeneDelivery Avoiding recombination

SyntheGeneDelivery Efficiently transfert & integrate the transgene at a specific site Stem cells Therapeutic gene Stem cell clones or population (?) Purify or select the genetically modified stem cells Control the quality of the cells to warrant safety Safe stem cell clones or population (?) Amplify safe stem cells Reimplant safe stem cells in patient Patient

SyntheGeneDelivery Challenges To efficiently transform stem cells with a FDA agreed product To solve the size limitation of mariner based vectors To target the transgene insertion at a defined “safe” locus We are only “tools conceptors”, not clinicians.

Thérapie cellulaire/génique SyntheGeneDelivery Un outil pour quoi faire ? Cellules usines ré-implantées : Greffe intra-musculaire Hemophilia A (f VIII) Hemophilia B (f IX) Diabètes insulino-dépendants Adulte ou enfant Thérapie cellulaire/génique DMD (micro-dystrophin) Osteogenesis Imperfecta type I Foetus