IMMUNOTHERAPIE ET THERAPIE CELLULAIRE Pr J-Olivier Bay, Service d’hématologie, CHU Clermont-Ferrand Département d’oncologie médicale, Centre Jean Perrin

STRATEGIES THERAPEUTIQUES DES CANCERS Chirurgie Chimiothérapie Radiothérapie Hormonothérapie Immunothérapie - Thérapie cellulaire Thérapie génique

EVOLUTION RECENTE (1) CONNAISSANCE DES MECANISMES IMMUNOLOGIQUES Mise en évidence des mécanismes de reconnaissance par le système majeur d’histo-compatibilité (MHC) (Zinkernagel 1979) Mise en évidence des structures moléculaires MHC type 1 et 2 (Bjorknan 1987; Brown 1993) Mise en évidence des mécanismes de présentation antigénique (Townsend 1986; Lechler 1996) Identification des récepteurs spécifiques d’antigène sur les lymphocytes T Identification des mécanismes de reconnaissance et d’activation des lymphocytes T Découverte des cytokines et des facteurs de croissance et détermination de leurs rôles respectifs Développement des anticorps monoclonaux

EVOLUTION RECENTE (2) AMELIORATION DES TECHNIQUES Progrès majeur dans les techniques de laboratoire - reconnaissance des cellules (anticorps monoclonaux) - technique de cytaphérèse - technique de congélation - culture ex-vivo des cellules - manipulation des greffons - expansion ex-vivo Progrès à mettre en parallèle avec l’amélioration des techniques de biologie moléculaire et les connaissances sur la carcinogenèse Interconnexion entre la biologie moléculaire et la thérapie cellulaire

CLASSIFICATION DES METHODES D’IMMUNOTHERAPIE (1) Stimulation antigénique III Activation des lymphocytes T auxiliaires II Cellules dendritiques Production de cytokines VII VI Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B V Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC IV

CLASSIFICATION DES METHODES D’IMMUNOTHERAPIE (2) Immuno-adjuvants (immuno-stimulants) Immunothérapie active non spécifique ou spécifique Anticorps monoclonaux Immunothérapie par les lymphocytes T cytotoxiques Immunothérapie adoptive (thérapie cellulaire non spécifique ou spécifique) Immunothérapie utilisant des techniques de thérapie génique I II III IV V VI VII VIII

IMMUNO-ADJUVANTS I I Stimulation antigénique Activation des lymphocytes T auxiliaires Cellules dendritiques Production de cytokines Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC

IMMUNOADJUVANTS I Il s’agit d’agents bactériens ou synthétiques qui facilitent la réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis d’antigènes tumoraux spécifiques ou qui augmentent l’immunité non spécifique. premiers essais : toxines de streptococcus pyogènes ou de serratia marcescens (toxine de Coley) actuellement : bacille de Calmette et Guerin (B.C.G. thérapie) et corynebacterium parvum (C. parvum)

MECANISME D’ACTION ANTITUMORALE fixation du B.C.G. sur les cellules tumorales et les cellules épithéliales (récepteur à la fibronectine), mobilisation des cellules CD4+ de phénotype T avec une activité cytotoxique spécifique, des cellules CD8+, activation des cytokines INF-a, IL-10, IL-12, TNFa grâce lymphocytes T helper. La mémoire cellulaire des CD4 explique la durée de la réponse. Les suspensions de C. parvum tuées augmentent la cytotoxicité des macrophages, induisent l’activité NK et stimulent l’activité anti-tumorale spécifique. Levamisole : dérivé synthétique sulfuré possédant une activité anti-helminthe L’OK-432 (picibanil) est une préparation obtenue à partir de toxines de streptococcus pyogène. Il induit une activation macrophagique et une sécrétion de TNFa.

APPLICATIONS CLINIQUES Cancers de l’ovaire Cancers de la vessie

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE NON SPECIFIQUE II Stimulation antigénique Activation des lymphocytes T auxiliaires II Cellules dendritiques Production de cytokines Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE NON SPECIFIQUE II Majoritairement représentée par l’utilisation clinique des cytokines Cytokines (cyto : cellule ; kine : facteur) : médiateurs physiologiques des communications intercellulaires, utilisables en culture ex vivo Actions autocrine, paracrine ou/et endocrine Utilisation clinique : IL-2, INFs, facteurs de croissance, TNFa

INTERLEUKINE-2 Identifiée en 1976 produite par les lymphocytes T auxiliaires actif sur les lymphocytes T et B si reconnaissance d’un antigène spécifique (acquisition du récepteur à l’IL-2) relative spécificité de la réponse immunitaire activation immédiate des cellules NK : LAK

UTILISATION ACTUELLE ET FUTURE DE L’INTERLEUKINE 2 Cancer du rein Mélanomes malins (Kirkwood J. Clin. Oncol. 2000; 18 : 2444-58) Cancer de l’ovaire Post réinjection de lymphocytes T allogéniques Voie IV ou SC

INTERFERONS IFN de type 2 (INFg) Facteurs de résistance aux virus a produit par les cellules hématopoïétiques b produit par les fibroblastes activité biologique identique (même récepteurs) augmente l’expression MHC type I stimule les cellules NK (LAK) IFN de type 2 (INFg) produit par les lymphocytes T auxiliaire, cytotoxique et cellules NK activateur puissant des macrophages et des cellules NK stimule la production d’immunoglobulines inhibe la production d’IL4

UTILISATION ACTUELLE ET FUTURE DES INTERFERONS leucémie à tricholeucocytes leucémie myéloïde chronique myélome multiple lymphome non Hodgkinien de bas grade cancer du rein mélanome malin Cancer superficiel de la vessie (Belldegrun J. Urol.1998; 159 : 1793-1801) Tumeurs gliales malignes ? (Borden Cancer Biology 2000; 10 : 125-144) Cancer ovarien ? (Windbichler Br. J. Cancer 2000; 82 : 1138-44)

TNFa - INTERLEUKINE 1 IL1 a et b TNF a et b TNFa : précurseur membranaire : activité pro-inflammatoire puissante TNFa soluble : puissant activateur des cellules NK application en clinique : perfusion isolé de membre, traitement intra-péritonéal application biologique : culture ex vivo

LES FACTEURS DE CROISSANCE Cytaphérèses Cultures ex vivo Réduction des toxicités médullaires post chimiothérapie Dysmyélopoïèse Effet anti-tumoral du GM-CSF (Spitler J. Clin. Oncol. 2000; 18 : 1614-21)

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE SPECIFIQUE III Stimulation antigénique III Activation des lymphocytes T auxiliaires Cellules dendritiques Production de cytokines Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC

IMMUNOTHERAPIE ACTIVE SPECIFIQUE III Utilisation de peptides antigéniques tumoraux Vaccination autologue ou allogénique Peptides synthétisés à partir des épitopes reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques Reconnaissance restreinte par MHC type I ou II MAGE3 / HLA-A1 dans les mélanomes Analogue du peptide gp100 / HLA-A2 dans les mélanomes Gangliosides (GM2) (Levingston Semin. Oncol. 1998; 25 : 636-45)

ANTICORPS MONOCLONAUX IV Stimulation antigénique Activation des lymphocytes T auxiliaires Cellules dendritiques Production de cytokines Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC IV

ANTICORPS MONOCLONAUX IV activité anti-tumorale possible si un anticorps couplé à un agent-tueur (élément radio-actif, toxine ou drogue cytotoxique) est dirigé spécifiquement contre un antigène tumoral particulier problème de l’utilisation d’anticorps monclonaux d’origine murin Les techniques de biologie moléculaire permettent la constitution d’anticorps monoclonaux murins suffisamment humanisés (région constante humaine et région variable murine spécifique de l’antigène). Les risques d’immunisation sont ainsi beaucoup plus faibles.

ANTICORPS MONOCLONAUX ACTUELS Cibles : plutôt des onco-protéines fœtales ou des antigènes spécifiques de tumeurs anticorps monoclonal anti-EGF = C225 edrecolomab = anticorps monoclonal anti 17-1A (molécule d’adhésion) Herceptine induction de l’apoptose réduit la prolifération cellulaire effet synergique avec certaine drogues de chimiothérapie Rituximab : anti-CD20

ANTICORPS BI-SPECIFIQUES Il s’agit d’utiliser des anticorps bi-spécifiques liant les cellules tumorales et les cellules effectrices. Cancer de la prostate : anti-CD64 couplé à anti-HER-2 (James 1999 Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1197) Cancer du sein : anti-Fc couplé à l ’anti-HER-2/neu (Ojik Cancer Immunol. Immunother. 1997; 45 : 207-9) Cancer de l’ovaire : anticorps OC-TR qui fixe le récepteur CD3 du lymphocyte T et de l’autre côté, fixe les récepteurs aux folates des cellules de carcinome ovarien. (Canevari J. Natl. Cancer Instit. 1993; 87 : 1463-1469)

LYMPHOCYTES T CYTOTOXIQUES V Stimulation antigénique Activation des lymphocytes T auxiliaires Cellules dendritiques Production de cytokines Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B V Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC

LYMPHOCYTES T CYTOTOXIQUES V Lymphocytes T infiltrants les tumeurs (TIL) Réaction du greffon contre la tumeur dans les tumeurs solides évolution dans les hémopathies malignes Réinjection de lymphocytes T allogéniques

TIL Autrefois développés à la suite des essais cliniques sur les LAK Résultats cliniques décevants Préparation des cellules difficile et complexe

REACTION DU GREFFON CONTRE LA TUMEUR APPLICATION DANS LES TUMEURS SOLIDES

PRINCIPE DE L’ALLOGREFFE effet cytotoxique majeur par un conditionnement myélo-ablatif (chimiothérapie seule ou association radio/chimiothérapie) effet antitumoral immunologique par les lymphocytes T allogéniques (GVL ou GVT)

PRINCIPE DU CONDITIONNMENT NON-MYELOABLATIF (1) effet immunosuppresseur majeur avec myélotoxicité réduite absence de toxicité majeure à la chimiothérapie permet la réalisation de ce traitement chez des sujets plus âgés car: immunosuppression limitant les risques de GVH aiguë chez les sujets plus âgés toxicité réduite

PRINCIPE DU CONDITIONNEMENT NON-MYELOABLATIF (2) myélo-ablatif endoxan : 50 mg/m2 par jour pendant 4 jours consécutifs busulfan : 4 mg/kg par jour pendant 4 jours consécutifs immunosuppresseur fludarabine : 30 mg/m2 par jour pendant 5 à 6 jours consécutifs sérum anti-lymphocytaire : 2,5 mg/kg par jour pendant 1 à 4 jours consécutifs busulfan : 4 mg/kg par jour pendant 2 jours consécutifs

RATIONEL DES ALLOGREFFES DANS LES TUMEURS SOLIDES Théoriquement, l'effet GvL devrait être le même qu'un hypothétique effet GvT Certitude d’utiliser un greffon indemne de cellules tumorales Développement de conditionnements immunosuppresseurs Observations de GvH autologues Sensibilité de certains cancers à l’immunomodulation

ALLOGREFFE ET TUMEURS SOLIDES RESULTATS DE LA LITTERATURE

OBSERVATIONS Faisabilité démontrée Bonne prise des greffons Taux de GvH observé conforme au taux de GvH attendu Taux de réponse thérapeutique intéressant, surtout dans les cancers du rein Absence de données sur le suivi à long terme

REACTION DU GREFFON CONTRE LA TUMEUR (2) II DEVELOPPEMENT DANS LES HEMOPATHIES MALIGNES

INTERET DES CONDITIONNEMENTS NON-MYELOABLATIFS DANS LES HEMOPATHIES Réduction de la toxicité Application dans des hémopathies où la toxicité de la procédure rendait la greffe inutile (myélome multiple) Recul de l’âge limite Traitement possible même si le Karnovsky est inférieur à 80 % Application à d’autres maladies ?

LYMPHOCYTES T ALLOGENIQUES GvH et GvT sont-elles liées ? Risque de rechute leucémique corrélé au degré de réactivité immunologique représenté par l'intensité de la GvH aiguë (Blaise 1995) Risque de rechute plus faible en cas de GvH chronique (Weiden 1981, Sullivan 1989) Risque de rechute augmenté si greffon déplété en cellules T (Maraninchi 1987, Goldman 1988) Risque de rechute augmenté en cas de greffes syngéniques (Gale 1994) Risque de rechute plus important après autogreffe (Vey 1994) Quelques publications rapportent que cette relation n'est pas toujours aussi claire (Kolb 1995, Champlin 1995).

ROLE DES LYMPHOCYTES T ALLOGENIQUES la déplétion en cellules T (CD4 ou CD8) du donneur réduit ou évite la GvH présence de lymphocytes T allogéniques activés au niveau des lésions de la GvH activation de lymphocytes T cytotoxiques avec destruction des cellules du receveur et production de cytokines (IFN, IL2 etc...) outre la production des cytokines, l'effet GvL serait lié à la réactivité des lymphocytes T allogéniques contre des antigènes mineurs du MHC sur les cellules tumorales

MODALITES THERAPEUTIQUES Indications Myélome multiple (Lokhorst J. Clin. Oncol. 2000; 18 : 3031-37) Leucémie myéloïde chronique (Collins J Clin Oncol 1997 ; 15 : 433-44) Nombre de cellules à réinjecter Nombre total de réinjection Rythme des réinjections Manipulation ex vivo des lymphocytes T ?

THERAPIE CELLULAIRE NON SPECIFIQUE VI Stimulation antigénique Activation des lymphocytes T auxiliaires Cellules dendritiques Production de cytokines VI Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC

THERAPIE CELLULAIRE NON SPECIFIQUE VI LAK Macrophages activés

UTILISATION DE MACROPHAGES ACTIVES

INTERET Interféron  Activation ex vivo de macrophages Inhibition de l’activité tumoricide des macrophages par des facteurs extrinsèques (IL-10) Activation des macrophages : acquisition d’un pouvoir tumoricide ( TNF, radicaux libres)

MODE DE PRODUCTION DES MACROPHAGES ACTIVES (1) Obtention de cellules mononucléées par cytaphérèse Culture des cellules mononucléées Activation des macrophages Recueil des macrophages Administration des macrophages

MODE DE PRODUCTION DES MACROPHAGES ACTIVES (2) Cytaphérèse (3-6 109 cellules) Elutriation 18 h Macrophages Culture de 6 jours (37°c, GM-CSF 250 UI/ml) Interféron  (250 UI/ml) Injection (1-2 109 cellules)

APPLICATION CLINIQUE Cancer de l’ovaire (traitement en intra-péritonéal) Cancer du rein (Lesimple J. Immunol. 2001) Mélanome malin

THERAPIE CELLULAIRE SPECIFIQUE VII Stimulation antigénique Activation des lymphocytes T auxiliaires Cellules dendritiques Production de cytokines VII Effecteurs cytotoxiques non spécifiques Lymphocytes B Lymphocytes T cytotoxiques Natural Killers (NK) Lymphocytes tueurs activés par les cytokines (LAK) Macrophages activés Production d’anticorps spécifiques Structure de reconnaissance = récepteur spécifique d’antigène Reconnaissance sur les cellules cibles de peptides associés au SMHC

UTILISATION DE CELLULES DENDRITIQUES « PULSEES »

RATIONEL (1) “antigènes tumoraux” Cellules dendritiques (CD) Cellules NK LAK TIL MAK CTL Cellules effectrices Non restreint par le CMH Restreint par le CMH avec CD pour présentation des antigènes tumoraux

RATIONEL (2) Le développement d’une réponse immunitaire antitumorale efficace nécessite : l’expression d’antigènes spécifiques par les cellules tumorales (TAA), la présentation de ces antigènes par des cellules spécialisées (cellules dendritiques) aux lymphocytes T qui sont les effecteurs de la réponse immunitaire, la stimulation efficace de ces lymphocytes T et l’afflux des cellules effectrices sur le site tumoral.

INFLUENCE DE LA TUMEUR Facteurs immunosuppresseurs produits par la tumeur, IL6, IL10 Déficit dans la présentation des antigènes tumoraux Activation altérée des lymphocytes T Réponse antitumorale faible

MATURATION DES CELLULES DENDRITIQUES TNFa, IL1b, LPS 5 - 20 h 24 - 48 h Maturation CD immature activité endocytique forte synthèse de CMH I/II faible CMH I/II cytoplasmiques demi-vie des CMH II <10h co-stimulation T faible Etat de maturation intermédiaire activité endocytique forte synthèse de CMH I/II forte CMH I/II cytoplasmiques et membranaires CD mature activité endocytique faible synthèse de CMH I/II faible CMH I/II exclusivement à la surface cellulaire demi-vie des CMH II >50h co-stimulation T forte Stimulation des lymphocytes T Ingestion et apprêtement des antigènes

INTERET Activation ex vivo Présentation ex vivo aux cellules dendritiques des antigènes tumoraux spécifiques

MODE DE PRODUCTION DES CELLULES DENDRITIQUES M-CSF macrophages CD14+ GM-CSF+IL4 DC immature LPS CD40L DC mature GM-CSF+IL4 TGFb CD1a+ CD14- TNFa CD83+ CD86+ LC

PROTOCOLE J-7 J+1 J+1, J+8, J+15, J+22, J+52, J+82, J+112 J-11 à J-8 Prélèvement des cellules mononucléées Isolement des monocytes J+1 congélation des cellules dendritiques Prélèvement et congélation des cellules tumorales J+1, J+8, J+15, J+22, J+52, J+82, J+112 Administration des cellules dendritiques Consentement éclairé J-11 à J-8 administration de G-CSF J-7 à J+1 culture ex vivo des monocytes J-7 à J0 : Culture des monocytes (GM-CSF+IL4) J0 : Contact avec les lysats tumoraux autologues + TNFa J+1 : 1ere administration de cellules dendritiques congélation des cellules dendritiques

APPLICATIONS CLINIQUES Utilisation de lysats tumoraux autologues Utilisations d’antigènes spécifiques, de peptides, de corps apoptotiques, d’exosomes Mélanomes malins (Panelli J. Immunol. 1999; 23 : 487-98) Cancer de la prostate (Small J. Clin. Oncol. 2000; 23 : 3894-903)

IMMUNOTHERAPIE UTILISANT DES TECHNIQUES DE THERAPIE GENIQUE VIII Modèle des gènes suicides Codent pour des enzymes pouvant convertir la forme inactive d’une drogue en un produit toxique inhibant la synthèse des acides nucléiques Le produit du gène HSV-Tk convertit le gancyclovir en une forme phosphorylée toxique. Introduction ex vivo dans les lymphocytes T allogéniques d’adénovirus porteur du gène HSV-Tk pour traiter les GvH où transduction d ’adénovirus recombinant dans des lignées tumorales spécifiques (essai en court par Freeman et coll. dans les cancers de l’ovaire)

IMMUNOTHERAPIE UTILISANT DES TECHNIQUES DE THERAPIE GENIQUE Virus recombinants permettant l’expression de cytokines (INFg, IL-2...) Virus recombinants permettant l’expression d’anticorps monoclonaux spécifiques Virus recombinant permettant l’expression de peptides

MANIPULATION DES GREFFONS Sélections cellulaires (CD34, déplétion T, sous population T effectrices, cellules mésothéliales…) Expansion ex vivo Purge médullaire (anticorps monoclonaux, drogues…)

PERSPECTIVES Etroite collaboration entre le laboratoire de thérapie cellulaire et l’unité clinique Association de plusieurs modalités d’immunothérapie Association de plusieurs stratégies thérapeutiques Essais multicentriques

MODELE DES ALLOGREFFES DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES Indications et stades évolutifs Choix du conditionnement Choix du greffon Manipulation du greffon Immunosuppression à adopter Réinjection de cellules allogéniques

INDICATIONS Tumeurs ayant fait la preuve de leur sensibilité à des traitements immunologiques (cancer du rein, mélanomes) Tumeurs dont la localisation se situe au niveau des sites cliniques classiquement affectés par les GvH aiguës et/ou chroniques Tumeurs relevant d’intensification thérapeutique mais dont les greffons autologues sont généralement contaminés

STADES EVOLUTIFS Tumeurs peu évolutives Espérance de vie supérieure à 6 mois Absence de signes inflammatoires Cibles tumorales les plus minimes possibles Age limite ??

CHOIX DU CONDITIONNEMENT (Dansey Current Opi. Oncol. 2001; 13 : 27-32) Intensité du conditionnement - +

CHOIX ET MANIPULATION DU GREFFON Cellules souches hématopoïétiques d’origine médullaire versus cellules souches hématopoïétiques d’origine périphérique (Bensinger N. Engl. J. Med. 2001; 344:175-81) Déplétion T Sélection ex vivo de certaines cellules allogéniques (cellules dendritiques, macrophages …)

IMMUNOSUPPRESSION Rôle de la cyclosporine à déterminer Durée et dose de prescription Arrêt précoce ? Développement d’anticorps monoclonaux (anti récepteur à l ’IL-2 par exemple) Intérêt du méthotréxate ? Utilisation de gènes suicides ?

REINJECTION DE CELLULES T ALLOGENIQUES Type de cellules à réinjecter (lymphocytes T, macrophages, cellules dendritiques plus ou moins activés ex vivo …) Dose ? Rythme ? Moment ?