Evaluation de l’effet matrice lors de l’analyse de stupéfiants par lc-ms-ms M. DEVILLE Service de Toxicologie Clinique, Médico-légale, de l’Environnement et en Entreprise (Prof. C. CHARLIER) CHU de Liège, Belgique Je remercie le groupe des jeunes scientifiques de la SFTA de me donner l’opportunité de faire cette présentation aujourd’hui. Je vais vous présenter l’évaluation… Ce travail a été réalisé dans notre laboratoire au CHU de Liège. Réunion Jeunes Scientifiques 21ème congrès de la SFTA, 51ème congrès de la STC Saint Malo, 11-14 juin 2013

Plan de l’exposé 1. Introduction 2. Méthodes d’évaluation 3. Résultats 4. Conclusions Je commencerai ma présentation par une brève introduction, suivie de quelques explications sur les méthodes utilisées. J’aborderai ensuite les résultats obtenus, et je terminerai par une conclusion.

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Définition: altération du processus d’ionisation de l’analyte d’intérêt, due à la présence de composés (endogènes ou exogènes) qui coéluent Augmentation du signal Diminution du signal Solutions: Préparation de l’échantillon: PPT > SPE > LLE Séparation chromatographique Technique d’ionisation: APCI < ESI (NI < PI) Standards internes marqués Avant toute chose, qu’est-ce que l’effet matrice? Il s’agit d’une altération du processus d’ionisation de l’analyte, due à la présence de composés non détectés qui coéluent. Une large variété de molécules peuvent mener à des EM, surtout si elles sont présentes à concentration élevée: Il peut s’agir de composés endogènes, présents dans la matrice au départ, tels que des lipides. Il peut également s’agir de composés exogènes, absents de la matrice au départ mais provenant de différentes sources extérieures, par exemple des résidus de plastiques provenant des tubes. L’EM n’est donc pas limité aux composés présents au départ dans la matrice, contrairement à ce que le terme suggère. Quelle que soit leur origine, ces composés vont entraîner soit une amplification d’ionisation avec une augmentation du signal, soit une suppression d’ionisation avec diminution du signal. L’EM est propre à la spectrométrie de masse, et n’est autre que l’équivalent d’une interférence en détecteur à barette de diode. Différentes solutions peuvent être envisagée pour éliminer ou, en tous cas, réduire, les EM: - La première solution concerne la Préparation de l’échantillon: en effet, les EM sont souvent liés à une purification insuffisante des matrices. Dans ce contexte, la technique de précipitation protéique est la moins efficace, suivie, en règle générale, de l’extraction en phase solide. Et c’est l’extraction liquide-liquide qui génère les extraits les plus propres. - Une deuxième solution pour remédier aux EM consiste à optimiser la Séparation chromatographique: afin d’éloigner les analytes cibles des zones où les effets matrices sont prononcés. - 3ème solution: on peut, si possible, changer de technique d’Ionisation: puisque l’APCI est moins sujette aux EM que l’ESI (car la technique d’ionisation est différente). - Enfin, l’utilisation de Standards internes marqués permet de compenser les EM, puisque l’analyte et sont SI ont le même temps de rétention, ils seront soumis aux mêmes effets matrices.

2. METHODES D’EVALUATION 1ère approche INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS 2. METHODES D’EVALUATION 1ère approche Addition post-extraction : comparaison des aires A: phase mobile enrichie en standard B: matrice extraite puis enrichie en standard EM absolu (%) = B/A x 100 (corrigé ou non par le SI) EM relatif (%) = CV A Maintenant que le problème a été défini, quelles sont les méthodes qui permettent de le mettre en évidence? Il existe 2 stratégies principales d’évaluation. La première est l’addition post-extraction, publiée par Matuszewski en 2003. Elle consiste à comparer l’aire des pics obtenus lors de 2 injections. La première est une injection de ph mobile, enrichie en standard, donc sans matrice. La seconde injection concerne la matrice extraite puis enrichie en standard. A et B contiennent le standard à concentration identique. L’EM absolu est donné par la formule B/A * 100, qui peut être corrigée par le standard interne. Si le résultat = 100: il n’y a pas d’effet matrice Si l’EM >100: il y a amplification d’ionisation Si l’EM<100: il y a suppression d’ionisation L’EM relatif permet, quant à lui, de comparer les effets matrices entre différents lots de liquides biologiques. Il correspond au coefficient de variation obtenu lorsque l’opération a été répétée sur des matrices d’origine différente. Cette stratégie d’évaluation fournit une information quantitative sur l’effet matrice mais limitée au temps de rétention du composé étudié, il s’agit donc d’une approche statique; comparativement à la seconde stratégie d’évaluation… B

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS 2ème approche Infusion post-colonne: observation de la variation du signal … qui est l’infusion post-colonne, au cours de laquelle l’analyte est infusé directement dans la masse et génère un signal constant en l’absence d’EM. Simultanément, on injecte une matrice extraite au préalable, mais sans analyte. L’élution de composés capables de supprimer ou d’accroître l’ionisation va engendrer une diminution ou une augmentation du signal, respectivement. Dans ce cas, l’information sur l’effet matrice est seulement qualitative mais couvre l’entièreté du chromatogramme. Il s’agit donc d’une approche dynamique qui permet d’identifier les régions du chromatogramme qui sont plus sensibles aux effets matrices. Ces 2 méthodes d’évaluation, l’addition post-extraction et l’infusion post-colonne, ont été appliquées à 2 milieux biologiques (salive et sérum) analysées par deux techniques ( préparatives et chromatographiques) distinctes. Analyte infusé dans la masse Matrice (sans analyte) extraite et injectée dans les conditions chromatographiques établies

3. RESULTATS DOSAGE DES CANNABINOIDES INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS 3. RESULTATS DOSAGE DES CANNABINOIDES Sérum ou salive Acide acétique Hexane/acétate d’éthyle (9/1 : v/v) Agitation – centrifugation – évaporation phase organique Colonne: Acquity BEH C18 (2.1 x 5 mm) Phase mobile: Tampon bicarbonate NH4 10mM - pH 10 (A), MeOH (B) Gradient: La première technique soumise à l’évaluation des EM est le dosage des cannabinoïdes. Ceux-ci sont extraits de la salive et du sérum par une extraction liquide-liquide puis analysés en 3 minutes sur une UPLC Acquity couplée à un spectromètre de masse Quattro premier de chez WATERS. Temps (minutes) Débit (ml/min) % A % B 0.45 50 0.3 2 5 95 2.9 3

Cannabinoïdes Addition post-extraction INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Cannabinoïdes Addition post-extraction Sérum (n=20) Salive (n=15) Composé EM moyen sans SI (%) Correction par le SI EM moyen (%) CV (%) THC 81 100 1.6 THC-OH 125 1.1 THC-COOH 93 2.6 L’addition post-extraction a été réalisée sur 20 sérums et 15 salives: voici les résultats obtenus. Avec un EM inférieur à 100%, le THC et le THC-COOH subissent une suppression d’ionisation Le THC-OH subit quant à lui une amplification d’ionisation. Dans les deux cas, l’altération d’ionisation est compensée par le standard interne marqué: en effet, en sa présence, le rapport des aires obtenues avec et sans matrice se rapproche de 100% Enfin, l’effet matrice est relativement constant d’un échantillon à l’autre, avec, dans ce cas, des coefficients de variation en dessous des 5%. Composé EM moyen sans SI (%) Correction par le SI EM moyen (%) CV (%) THC 93 102 4.1

Cannabinoïdes Infusion post-colonne INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Cannabinoïdes Infusion post-colonne Phase mobile versus sérum dont l’EM = 22% en l’absence de SI: suppression d’ionisation visible au temps de rétention du THC Phase mobile Concernant l’infusion post-colonne, sur ce chromatogramme, on peut observer une injection de phase mobile, en rose, et une injection de sérum en noir, le tout pendant l’infusion du THC. On remarque, au temps de rétention du THC, que le sérum entraine une chute importante du signal comparativement à la phase mobile. Pour le THC, l’EM moyen est de 81%. Mais le sérum injecté dans ce cas présentait un effet matrice calculé beaucoup plus important, chiffré à 22%. Sérum Tr du THC

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS DOSAGE DES AMPHÉTAMINES, DE LA COCAINE, DES OPIOIDES, DES OPIACÉS ET MÉTABOLITES Sérum ou salive HCl SPE (OASIS MCX 1ml 30mg) Elution par NH4 dans MeOH – évaporation Colonne: Acquity HSS T3 (2.1 x 10 mm). Phase mobile: Tampon formate d’NH4 5mM – pH 3 (A), MeOH (B) Gradient: La deuxième analyse soumise à l’évaluation des effets matrices concerne le dosage des amphet, cocaine, opioides et opiacés. Ceux-ci sont extraits de la salive et du sérum par une extraction en phase solide et dosés sur la même machine, avec un temps d’analyse de 19minutes. Temps (minutes) Débit (ml/min) % A % B 0.5 100 1 2 92.5 7.5 5.5 89 11 16 10 90 17 18 19

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Amphétamines, cocaïne, opioïdes, opiacés et métabolites Addition post-extraction Sérum (n=20) Composé EM moyen sans SI (%) Correction par le SI EM moyen (%) CV (%) Morphine 105 99 6.6 M6G 91 108 3.3 M3G 79 4.2 6-MAM 129 114 4.3 Hydromorphone 154 100 4.4 Codéine 144 2.8 Dihydrocodéine 141 92 5.7 Hydrocodone 224 95 6.9 Oxycodone 254 102 3.1 Buprénorphine 42 5.8 Méthadone 73 98 0.9 EDDP 76 97 1.5 Les résultats obtenus lors de l’addition post-extraction sont les suivants: Dans le sérum, on note, dans certains cas une suppression d’ionisation pouvant aller jusqu’à perdre plus de la moitié du signal pour la buprénorphine. Dans d’autres cas, on observe une amplification d’ionisation qui peut monter jusqu’à 254% pour l’oxycodone.

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Amphétamines, cocaïne, opioïdes, opiacés et métabolites Addition post-extraction Sérum (suite) Composé EM moyen sans SI (%) Correction par le SI EM moyen (%) CV (%) Amphétamine 182 121 8.1 Méthamphétamine 154 109 3.7 MDMA 166 94 5.2 MDA 179 127 3.9 MDEA 152 105 2.6 MBDB 147 108 1.9 Cocaïne 117 99 1.3 Benzoylecgonine 102 1.8 Cocaéthylène 81 100 1.4 Parfois, l’effet matrice peut être très faible. C’est le cas de la benzoylecgonine, pour laquelle on observe un effet matrice de 94% seulement. Dans tous les cas, l’effet matrice est corrigé par le standard interne marqué. D’une matrice à l’autre, l’effet est relativement stable, avec un CV toujours bien inférieur à 10%.

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Amphétamines, cocaïne, opioïdes, opiacés et métabolites Addition post-extraction Salive (n=15) Composé EM moyen sans SI (%) Correction par le SI EM moyen (%) CV (%) Morphine 77 102 6.5 6-MAM 83 101 3.7 Codéine 145 2.3 Amphétamine 74 3.0 Méthamphétamine 64 98 6.0 MDA 51 4.2 MDMA 50 2.7 MDEA 63 99 MBDB 3.2 Cocaïne 88 1.5 Benzoylecgonine 1.1 EM sans SI – sérum 182 154 179 166 152 147 Dans la salive, 11 molécules sont dosées. Comparé au sérum, les chiffres ne sont pas les mêmes. Par exemple, dans le sérum, toutes les amphétamines subissaient une amplification d’ionisation, alors que dans la salive, l’effet est inversé.

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Amphétamines, cocaïne, opioïdes, opiacés et métabolites Infusion post-colonne Phase mobile versus sérum dont l’EM = 23% en l’absence de SI: suppression d’ionisation visible au temps de rétention de l’EDDP Phase mobile De la même manière que pour le cannabis, les effets matrices importants peuvent se vérifier par infusion post-colonne. Sur ce chromatogramme, on peut observer une injection de phase mobile, en rose, et une injection de sérum en noir, le tout pendant l’infusion de l’EDDP. On remarque, au temps de rétention de l’EDDP, que le sérum entraine une chute importante du signal comparativement à la phase mobile. Pour l’EDDP, l’EM moyen est de 76%. Mais le sérum injecté dans ce cas présentait un effet matrice calculé de 23% Sérum Tr de l’EDDP

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Amphétamines, cocaïne, opioïdes, opiacés et métabolites Infusion post-colonne Sérum versus salive: spécificité des composés qui interfèrent. La diminution du signal, observée de manière régulière dans le sérum, ne se retrouve pas dans la salive Une autre constatation peut être faite lors de l’infusion post-colonne. Ce chromatogramme représente une injection de sérum en rose, superposée à une injection de salive, en noir. On observe une chute importante et régulière du signal, uniquement dans le sérum, mais quel que soit le sérum injecté, et quel que soit le composé infusé. L’effet matrice n’est donc pas dépendant de la transition étudiée, mais bien du temps de rétention. Sérum Salive

INTRODUCTION – METHODES – RESULTATS – CONCLUSIONS Supériorité de l’approche par addition post- extraction pour l’évaluation de l’EM Les effets matrice Sont bien présents Dépendent de la nature de la matrice Varient en fonction du composé (Tr) Sont compensés par l’utilisation d’un standard interne marqué Pour conclure, l’addition post-extraction semble supérieure à l’infusion post-colonne, car elle fournit des résultats quantitatifs et elle est plus rapide à mettre en œuvre. …