Expression du Génome Le transcriptome

Déchiffrage de l’Information Génique L’information est encodée dans la séquence de nucléotides contenus dans des unités discrètes Les gènes L’information contenue dans les gènes est transcrite pour générer les ARNs puis décodée pour générer les protéines

Les Gènes Seulement un des deux brins d’un gène est codant! Exons Site d’initiation de la transcription Region 3’ nontraduite Region 5’ nontraduite Introns Promoteur/ Region régulatrice 5’ Séquence de terminaison 3’ Transcrit d’ARN Exon 2 Exon 3 Int. 2 Exon 1 Int. 1 Exons Seulement un des deux brins d’un gène est codant!

Codant Brin Codant Brin positif Brin sens Brin complémentaire à la matrice Brin dont la séquence est la même que celle de l’ARN transcrit Brin sur lequel se retrouve le promoteur 4

Non Codant Brin non Codant Brin négatif Brin anti sens Brin matrice Brin dont la séquence est complémentaire à celle de l’ARN transcrit 5

Codant Vs Non-codant ADN: 5’ TAG 3’ 3’ ATC 5’ Transcription ARN: ? 5’ Traduction Leu Protéine: Code génétique: CUA = Leu UAG = Arrêt

Transcription - Traduction Brin matrice 3’ Brin codant 5’ Brin sens 5’ NH3— — COOH

ORFs Toutes les séquences double brins ont nécessairement 6 cadre de lectures GCCGATTAGAGA> TGCCGATTAGAG> ATGCCGATTAGA> 5’-ATGGCGATTAGAGACAGCCATTAA-3’ 3’-TACTGCTAATCTCTGTCGGTAATT-5’ <CTGTCGGTAATT <TCTGTCGGTAAT <CTCTGTCGGTAA Combien d’ORFs est-ce que cette séquence possède?

Homologues Séquences de gène qui possèdent un ancêtre commun Les Homologues partage un niveau d’identité élevée Identité Pourcentage de bases ou d’acides aminés qui sont les mêmes entre différentes séquences

Homologue Nucléotidique Séquences dont l’identité est plus élevée que 70% Ex. Un homologue de l’hémoglobine humaine dans le soya G.G.T.G.A.G.G.G.T.A.T.C.A.T.C.C.C.A.T.C.T.G G.G.T.C.A.G.G.A.T.A.T.G.A.T.T.C.C.A.T.C.A.C * * * * * * * * * * * * * * * * 77% identité

Homologues protéiques Séquences protéiques avec plus de 25% d’identité Ex. Une protéine homologue de l’hémoglobine humaine se retrouve dans le soya G A R G G W L G.G.T.G.A.G.G.G.C.A.T.C.A.T.C.C.C.A.T.C.T G.G.T.C.A.G.G.A.C.A.T.G.A.T.T.C.C.A.T.C.A G T P M I W E Pourcentage d’identité: 28%

Homologues Orthologues : Paralogues : Homologues retrouvé dans différents organismes qui ont ancêtre commun Duplication suivie spéciation Paralogues : Homologues retrouvé dans la même espèces Duplication avant la spéciation

Mutations

Mutations Ponctuelles Faux Sens - Neutre Synonyme/Silencieuse : Changement de base qui ne change PAS l’acide aminé Ex. AGG → CGG tous deux Arg Faux Sens - Non-Synonyme - Conservée: Changement de base qui change l’acide aminé pour un autre semblable Même charge et forme Ex. AAA → AGA Lys à Arg tous deux sont basiques

Mutations Ponctuelles Faux Sens - Non-Synonyme – Semi-conservée: Changement de base qui change l’acide aminé à un semblable Même forme différente charge Ex. CGC → CUC Arg (Polaire) à Leu (non polaire) Faux Sens - Non-Synonyme – Non-conservée: Changement de base qui change l’acide aminé à un différent Différente forme et charge

Mutations Ponctuelles Non Sens Changement de base qui crée un codon stop prématuré dans l’ORF Cause l’arrêt prématuré de la traduction Protéine tronquée Indel – Insertion ou délétion d’une seule base dans l’ORF: Change le cadre de lecture Change la séquence protéique Peut causer l’arrêt prématuré de la traduction

Répertoire d’ARN des gènes qui codent pour des protéines Génome Transcription Transcriptome Répertoire d’ARN des gènes qui codent pour des protéines Répertoire d’ARN qui représente la fraction du génome qui est exprimée Traduction Protéome Répertoire de protéines dérivées du transcriptome

Un Génome Le transcriptome est-il le même dans toutes les cellules d’un organisme? Le transcriptome est-il toujours le même dans une cellule donnée?

Est-ce qu’une Séquence Code pour un Transcrit? Analyse d’hybridations northern  RT-PCR 

Comparaison des Méthodes Northern RT-PCR Séquence doit être connue Non Oui Présence ou absence d’un transcrit Oui Oui Permets de déterminer la taille Oui Non Sensibilité Faible Élevée Comparer l’abondance relative Oui Oui Obtenir la séquence du transcrit Non Oui Déterminer quel brin d’ADN est transcrit Oui Oui Déterminer combien de transcrits sont fait à partir d’une séquence Oui Non LA SÉQUENCE DOIT ÊTRE EXPRIMÉE OUI OUI

Analyse northern Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu Séparer les ARN d’après leurs grosseurs sur gel d’agarose dénaturant Formaldéhyde + Formamide Hybridation avec une sonde complémentaire ARNr ARNt

Hybridation northern Nécessite une sonde Hybridation = la sonde possède des séquences d’un gène La séquence est exprimée Intensité du signal d’hybridation = abondance relative Nombre de signaux d’hybridation = nombre de transcrit Possiblement nombre de gènes

Hybridation northern Permet de comparer la quantité relative d’un transcrit Sensibilité faible Requiert un témoin interne Gène dont l’abondance est constante sous les différentes conditions examinées Témoin pour les variations de la quantité d’ARN chargé Utilise des gènes domestiques : Gènes qui assurent les fonctions indispensables à la vie de tous les types de cellules Expression constitutive

La normalisation

Problème Un northern d’ARN isolé de différents tissus a été sondé avec le gène Fos et le gène domestique actine. Expliquer les résultats obtenus Tissus: F C R P Actine Fos

RT-PCR Permets d’amplifier une séquence d’ARN Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu Transcrire les ARN en ADNc avec transcriptase inverse Amplifier par PCR la séquence d’intérêt

Réaction de Transcriptase Inverse Gène Non-Spécifique AAAAAAA ARNm AAAAAAA TTTT Transcription d’ADNc T.I. AAAAAAA TTTT Appariement d’amorce polyT Collection d’ADN complémentaire aux ARNm exprimés à un temps donné sous une condition donnée

Réaction de Transcriptase Inverse Gène Spécifique AAAAAAA AAAAAAA Appariement d’une amorce gène spécifique ADN complémentaire à un ARNm d’intérêt AAAAAAA Synthèse d’ADNc T.I.

spécifiques à une séquence d’intérêt RT PCR Collection d’ADNc ADNc d’ARN d’intérêt PCR avec des amorces spécifiques à une séquence d’intérêt Analyse sur gel

RT-PCR La séquence doit être connue pour la conception d’amorces Produit d’amplification = Les séquences des amorces font partie d’un gène La séquence est exprimée Intensité du produit d’amplification = abondance relative La taille du produit d’amplification n’est pas égale à la taille du transcrit

Les Séquences et leurs Propriétés

Nucléotides ADN A, T, G, C ARN A, U, G, C

Appariement Les acides nucléiques peuvent s’apparier avec leur complément inverse Deux forces opposés influencent l’appariement Liaisons hydrogène favorisent l’appariement Groupement phospahtes favorisent la dénaturation

Appariement-température de fusion (Tm) Le Tm est la température à laquelle 50% des molécules sont simple brin (ou double brin) Le Tm est une fonction du: Pourcentage G:C Composition ionique de l’environment Le pourcentage de complementarité Estimé du Tm =2(#A:T) + 4(#G:C)

Tm Vs pourcentage G:C % Double Brin Température (C) (38%) G+C (52%) 70 80 90 100 50 100 (38%) G+C (52%) (58%) (66%) % Double Brin Température (C)

Tm Vs Conc. d’ions Positif 70 80 90 100 (0.1M NaCl) 50 100 (0.2M NaCl) (0.5M NaCl) % Double Brin Température (C)

Tm Vs pourcentage de Complémentarité 70 80 90 100 (25%) 50 100 (50%) (100%) % Double Brin Température (C)

Stringence Pourcentage de complementarité requise pour permettre la formation de duplex stable Le Tm influences les conditions de stringence qui permettent l’appariement Une stringence élevée requière un degré de complémentarité élevée GATCCGGTTATTA vs GATCCGGTTATTA CTAGGCCAATAAT CTTGGACGATAAT

Paramètres qui influencent la stringence  [Sel] = Stringence élevée  Température = Stringence élevée [Sel] = ?  Température = ?

4. Hybridation avec Sonde Libre Lavage

Détection : Autoradiographie

Propriétés de la Sonde Complémentarité Complète ou partielle? Complète; idéale; 100% complémentaire Partielle continue; acceptable 100% complémentaire Partielle discontinue; plus difficile Complémentarité partielle

Stringence d’Hybridation

La Sonde Molécule d’ADN ou d’ARN étiquetée Simple brin Double brin Brin spécifique (sens spécifique) Double brin Brin non spécifique (sens non spécifique)

Sonde Étiquetée à la Digoxygénine Détection indirecte Film rayons X S Y ENZ Ac-Dig conjugué Peroxydase D Sonde + Dig Cible Membrane

Signaux d’Hybridations Spécifique Non spécifique Bruit de fond Liaison de la sonde à la membrane Liaison de l’Ac à la membrane