Clonage des séquences pour les chaines lourdes (HC) et chaines légères (LC) dans les modules d’expression 3’TMV et 3’PVX Rappel: les séquences sont synthétisées après les avoir modifiées in silico pour tenir compte du biais de codon et de la modification de la glycosylation (ex. allez sur http://www.genscript.com/codon_opt.html)
Agroinfiltration des constructions suivantes dans les feuilles de N. benthamiana ARN proviral du TMV L’integrase permet la recombinaison in cellulo des 2 T-DNA permettant la synthèse d’un ARN proviral du TMV grâce à la RNA polymerase RNA dependante (RdRp), capable de se propager dans les cellules de la plantes grâce à la protéine de mouvement L’integrase permet la recombinaison in cellulo des 2 T-DNA permettant la synthèse d’un ARN proviral PVX capable de se propager dans les cellules de la plantes grâce à la protéine de capside et la protéine de mouvement du TMV
Agroinfiltration des constructions dans les feuilles de N. benthamiana Pénétration par les stomates et transformation de quelques cellules Idem mais version industrielle Trempage et mise sous vide modéré des plants de tabac « têtes en bas »
la plante et production des planticorps (HC+LC) Mise en culture pendant 7 jours et pendant ce temps infection systémique du virus dans toute la plante et production des planticorps (HC+LC) Extraction puis purification par chromatographie d’affinité sur colonne proteine A – sepharose (la protéine A fixe spécifiquement les anticorps) puis étapes successives de purification par chromatographie sur colonnes permettant d’éliminer des contaminants cellulaires