Correction du feuillet de TD exo-8-9-10-11-12 -Exercice 8- Vous effectuez un dosage d'Ouchterlony dans lequel le puits central contient de l'antisérum de chèvre dirigé contre le fragment F(ab)'2 d'IgG totales de souris, et dans lequel les puits voisins (A-F) contiennent six antigènes différents à tester. Le profil de précipitation résultant est représenté ci-dessous. En vous appuyant sur ce profil, indiquer quel puits contient chacun des antigènes à tester suivants : a- Segment Fab d'une protéine IgG de myélome (g2k2) b- Chaînes légères kappa. (k) c- Chaînes lourdes gamma (g) d- Chaînes légères lambda (l) e- Fragment Fc de la protéine de myélome IgG (g2k2) f- Mélange de chaînes lourdes g et de chaînes légères k

L'antisérum de chèvre est dirigé contre le fragment F(ab)'2 d'IgG totales de souris, Hg Ll/k Cet antisérum contient des Acm dirigés contre tous les éléments présent dans des Ig G totales sauf le Fc qui n’est pas présent dans le F(ab)’2. Autrement dit la chèvre ne produira pas d’Ac anti-Fc puisque celui-ci n’est pas présent dans le F(ab)’2 mais elle produit des Ac contre la totalité de chaque chaîne légère (ie Ac anti-Ll/k) et contre les parties VH et CH1 de la chaîne Hg présents dans le F(ab)’2. Avant de résoudre l’exo nous avons vu des rappels sur les différentes figures que l’on observe pour l’ouchterlony cf diapo suivantes

*Immunoprécipitation en milieu semi-solide (milieu gélifié) Technique Ouchterlony = Immunodiffusion double Méthode qualitative Dépôts Ac et Ag dans deux puits différents, diffusion des deux espèces jusqu'à la zone d'équivalence où va se former le précipité sous forme de ligne.

Intérêt de la technique Ouchterlony : Comparer des épitopes d'Ag différents Plusieurs profils observables : 1) L'identité : les Ag ont mêmes épitopes (courbe de précipitation « identique » = on observe une ligne continue)

2) La Non identité : les Ag n'ont pas les mêmes épitopes (précipitation indépendante: on observe deux lignes qui se croisent)

3) L'identité partielle: les Ag partagent certains épitopes (on observe un éperon c’est-à-dire UNE ligne unique de précipitation en face du premier puits puis qui se partage en deux en face du second puits)

Correction Exercice 8- e Pas d’immunoprécipitation entre puits Ac et puits F Cela signifie qu’il n’y a pas d’interaction c’est donc le Fc (e) qui est dans le puits F car aucun Ac reconnaissant le Fc n’est présent dans ce sérum comme nous l’avons indiqué précédemment

Identité partielle : elle indique la présence dans le puits A de deux épitopes différents portés par la même molécule d’Ag dont un est commun avec le puits B et C (ligne continue) a 2 épitopes différents portés par la même molécule d’Ag : il s’agit du (a) Fab gk e g k 2 épitopes différents portés par 2 molécules d’Ag distinctes : il s’agit du (f) mélange de chaîne lourde g et chaîne légère k f Deux lignes parallèles: cela indique 2 complexes Ag-Ac différents avec 2 zones d’équivalence distinctes. En clair on a 2 épitopes différents portés par 2 molécules d’Ag distinctes, l’un est commun avec puits A et B et l’autre est commun avec le puits D

A partir de ce moment deux solutions sont possibles: la première est la suivante Fab gk Si l’épitope commun entre les puits A, B et C est k alors on a k (b) dans le puits B et donc on a g (c) dans le puits D Et on observe une figure de « non identité » dans le puits E par rapport à puits D (deux épitopes différents) : il s’agit de (d) l Fcgg a e b d f c g et k

Fab gk Fcgg k l g et k g Avec ces couples Ag-Ac: a Ac anti-g-gk e b Ac anti-k-gk Ac anti-k-k Ac anti-l-l Ac anti-g-g Ac anti-g-g Ac anti-k-k l d f c g et k g

La deuxième : Fab gk Si l’épitope commun entre les puits A, B et C est g alors on a g (c) dans le puits B et donc on a k (b) dans le puits D Et on observe une non identité dans le puits E par rapport à puits D (deux épitopes différents) : il s’agit de (d) l Fcgg a e c d f b g et k

Fab gk Fcgg g l g et k k Avec ces couples Ag-Ac: a Les deux solutions sont valables sachant que l’un ou l’autre des deux complexes Ac anti-k-k ou Ac anti-g-g peut être le plus éloigné du puits de dépôt des Ag … En effet, on peut rappeler que plus l’Ag est concentré dans le puits de dépôt, plus la zone d’équivalence sera éloigné de ce puits pour une concentration fixe d’Ac. Ac anti-k-gk e b g Ac anti-g-gk Ac anti-g-g Ac anti-l-l Ac anti-k-k Ac anti-k-k Ac anti-g-g l d f c g et k k Or on ne connaît ni la concentration relative en Ac (anti-k et anti-g) ni la concentration relative des deux Ag k et g. Si l’Ag k est déposé en très large proportion par rapport à g (avec toutes les autres conditions comparables: même concentration pour les deux Ac, même nombre de sites de liaison pour chaque Ac sur leur Ag spécifique) alors il est possible d’imaginer que le complexe anti-k-k immunoprécipite plus loin du puits de dépôts des Ag que le complexe anti-g-g, comme c’est cas dans cette deuxième solution. Les deux solutions sont donc recevables.

Exercice 9- Le Dinitrophénole (DNP) est une petite molécule organique qui lorsqu'elle est introduite dans l'organisme ne suscite aucun anticorps. Comment appelle-t-on ce type de molécule ? Le DNP n’est pas présent dans l’organisme donc ce n’est pas du soi, il s’agit donc potentiellement d’un Ag qui pourra se fixer sur un BCR d’un lymphocyte B. Est-elle antigénique ? Donc oui c’est un antigène car c’est du « non soi » Est-elle immunogénique ? Non puisqu’on nous dit qu’elle ne suscite pas la production d’Ac On appelle ce type de molécule un HAPTENE qui, par définition, est un Ag non immunogène C’est le cas aussi de petites protéines (par exemple inférieure à 3-5 kDa)

Par quel procédé pouvez-vous rendre cette molécule immunogène ? Par couplage chimique à une grosse protéine immunogène (par exemple la BSA pour Bovine Serum Albumine) que l’on appelle protéine porteur (en français) ou carrier (en anglais) Déterminant antigénique propre à BSA BSA Multiples copies de DNP à la surface de BSA De manière à avoir une réponse Ac majoritairement dirigée contre cette molécule largement représenté à la surface de l’Ag Si on introduit ce nouvel Ag « DNP-BSA » dans une souris par immunisation (cf exo précédent pour le protocole de l’immunisation complet à décrire à nouveau ici !) on obtient dans le sérum de la souris trois grands type d’Ac: -des Acmx anti-BSA = x- -des Acmx anti-DNP= x- -des Acmx anti-DNP-BSA = x- Réponse majoritaire Réponse minoritaire

c) Décrire une procédure de sélection des anticorps monoclonaux spécifiques de cette molécule. On immunise une souris avec l’Ag « DNP-BSA » (avec ACF puis AIF). On vérifie que l’immunisation a marché en contrôlant dans le sérum immun la présence d’Ac dirigés contre la protéine ayant servi à l’immunisation (on pense au contrôle du sérum préimmun); pour cela on fait un ELISA avec DNP-BSA fixé sur la plaque, le sérum immun de la souris en Ac primaire et comme Ac secondaire des Ac de lapin anti-IgG souris couplés à la HRP. S’il y a les Ac spécifiques de l’Ag cela signifie que l’on peut trouver dans cette souris des B mémoires qui les produisent. L’idée est d’aller les chercher et de les immortaliser pour leur faire produire in vitro leur Ac monoclonal spécifique de l’Ag. Pour cela on utilise la technique des hybridomes cf diapo cours suivantes

Les Ac monoclonaux (technique des hybridomes) On sacrifie la souris et on extrait les cellules de la rate dont LB Naïfs, LB mémoires (notamment ceux produisant des Acmx anti-DNP) mais aussi des macrophages, cellules dendritiques, et autres cellules de la rate… On appelle les cellules fraîchement isolées “cellules primaires”, elles ont une durée de vie limitée et mourront si elles ne sont pas immortalisées, contrairement à des cellules obtenues à partir de lignées tumorales qui ont la caractéristique d’être immortelles et donc se divisent spontanément en culture. PEG 2) On fusionne les cellules primaires de la rate avec des cellules myélomateuses (=cellule cancéreuses B= plasmocytes cancéreux) à l’aide de Poly Ethylène Glycol Les cellules myélomateuses choisies pour cette expérience sont un peu particulières puisqu’elles ont été sélectionnées et modifiées de telle sorte qu’elles sont HGPRT-, TK-, Ig-. On verra que cela va rentrer en jeu dans la sélection négative des cellules cancéreuses seulement opar ka suite. Il y a formation d’hétérocaryons (issus de la fusion de deux cellules mais possédant deux noyaux) puis fusion des noyaux pour former les hybridomes conservant une partie du matériel génétiques de chacun d’eux.

Dans le milieu, on aura plusieurs types de cellules, non fusionnées ou fusionnées, sachant que rien n’empêche les fusions non désirées, notamment rien n’empêche une cellule primaire de fusionner avec une cellule primaire ou une cellule cancéreuse de fusionner avec une cellule cancéreuse… On obtient donc le mélange cellulaire suivant : -cellules primaires (B;T; MP; DC, etc…) non fusionnées -hybridomes “cellules primaires-cellules primaires” -hybridomes cellules primaires (dont B, T, MP, DC etc…)-cellules myélomateuses -hybridomes cellules myélo-cellules myélo -cellules myélomateuses non fusionnées Les cellules primaires non fusionnées ou fusionnées entre elles meurent par apoptose car durée de vie limitée C’est donc parmi celles-là que l’on trouvera des hybridomes B-myélo produisant les Acm anti-DNP Celles-là ne nous intéressent pas du tout et se divisent vite : on va s’en débarasser par culture du mélange cellulaire sur un milieu sélectif appelé milieu HAT : Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine. Sachant que l’Hypoxanthine et la Thymidine sont deux bases préformés qui ajoutées au milieu permettent aux cellules de synthétiser, à partir de ces deux composés, l’ensemble des autres bases par la voie de synthèse des acides nucléiques dite “de récupération” à conditions qu’elles aient les enzymes impliquées dans cette voie = HGPRT (Hypoxanthine Guanine PhosphoRibosyl Transferase) et TK (Thymidine Kinase) Et que l’Aminoptérine est un inhibiteur de la voie de synthèse de novo Donc sur milieu HAT, seules vont survivre les cellules capables de se diviser (caractère cancéreux acquis) et possèdant les enzymes HGPRT et TK donc seules les Hybridomes cellules primaires-cellules myélo seront conservées !

Prolifération clonale Test ELISA pour la présence d’Acm x-Ag Principe de sélection sur milieu HAT: Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine Voies de synthèse des acides nucléiques Voie de novo Phosphoribosyl pyrophosphate ADN + Uridylate Voie de récupération Hypoxanthine Thymidine HGPRT TK aminoptérine Seules les hybridomes (cellule primaire-myélo) survivent Les hybridomes (myélo-myélo) meurent ainsi que les cellules myélo non fusionnées car elles sont HGPRT- et TK- LB-myélo MP-myélo Autre-myélo Prolifération clonale Test ELISA pour la présence d’Acm x-Ag Dilution limite

Test 1 Ag =DNP-BSA Aucun Ac Ac anti-BSA Ac anti-DNP Ac anti-DNP-BSA -Hybridomes B naïfs-myélo ou T, MP, DC etc-Myélo ne produisent pas d’Ac -Hybridomes Bm-myélo produisent des Acmx anti-BSA, des Acmx anti-DNP ou des Acmx anti-DNP-BSA On va sélectionner les clones intéressants par ELISA contre l’Ag désiré ici DNP ne peut pas être fixé sur le plastique, il faut une protéine, on va utiliser BSA-DNP comme Ag, le surnageant des hybridomes clonés en tant qu’Ac primaire et un Ac secondaire= Ac de lapin anti-IgG de souris couplés avec la HRP Test 1 Ag =DNP-BSA Aucun Ac Ac anti-BSA Ac anti-DNP Ac anti-DNP-BSA Résultat ELISA - + Avec test 1, on n’a pas le résultat: on est obligé de rajouter un test 2 contre l’Ag= BSA seule. Les hybridomes produisant les Acm anti DNP sont ceux qui donnent un résultat franchement + au test 1 et franchement négatif au test 2; sachant que s’ils reconnaissent DNP-BSA mais pas la BSA seule, c’est bien qu’ils ont reconnus DNP au sein de DNP-BSA! Test 2 Ag =BSA Aucun Ac Ac anti-BSA Ac anti-DNP Ac anti-DNP-BSA Résultat ELISA - + +/-

Exercice 12- Vous avez à votre disposition uniquement la protéine GFP (Green Fluorescence Protein) et la protéine de fusion X-GFP (protéine X fusionnée avec la GFP). Décrire un protocole permettant de sélectionner un anticorps monoclonal spécifique de la partie X. Exercice 12- le même que l’exo 9 On remplace DNP par X et BSA par GFP Brièvement, On immunise la souris avec X-GFP. On vérifie l’immunisation puis technique des hybridomes et sélection des hybridomes, après dilution limite, grâce à l’association de deux tests ELISA : il faut test 1 contre X-GFP positif et test 2 contre GFP seule négatif. Si on avait disposé de la protéine X seule, on aurait pu se contenter d’un test ELISA du surnageant de chaque hybridome contre X.

Exercice 10- La technique ELISA a permis de sélectionner un anticorps monoclonal spécifique d'un antigène protéique. Cette interaction a été montrée de haute affinité. Expliquer pourquoi cet anticorps ne réagit pas avec l'antigène en immunodiffusion ou en Western-blot ? en immunodiffusion il faut Ag divalent / pas en ELISA en Western-blot l’Ag est dénaturé /pas en ELISA Cela signifie que l’Acm reconnaît un épitope représenté de manière unique à la surface de l’Ag (l’Ag est « monovalent ») et que cet épitope est de nature conformationnelle (« épitope conformationnel »). Il est donc détruit par le traitement utilisé en Western Blot.

Exercice 11- Vous avez une protéine X de myélome (une Ig donc!) dont l'isotype est inconnu et diverses autres protéines de myélome connu (par exemple IgG, IgM, IgA). Comment pourriez-vous produire des anticorps anti-isotype qui puissent être utilisés pour déterminer l'isotype de la protéine X de myélome ? Même procédé expérimental que exo 2c Brièvement, IgG + bmercapto ou papaïne; SDS-PAGE (bande Hg ou Fcg) puis électoélution/dialyse puis injection dans lapin 1 IgM+ bmercapto ou papaïne; SDS-PAGE (bande Hm ou Fcm) puis électoélution/dialyse puis injection dans lapin 2 IgA+ bmercapto ou papaïne; SDS-PAGE (bande Hg ou Fcg) puis électoélution/dialyse puis injection dans lapin 3 b. Comment pourriez-vous utiliser cet anticorps anti-isotype pour mesurer le taux de la protéine X de myélome dans le sérum normal ? Admettons que l’on ait déterminé que l’isotype de X soit par exemple g par ELISA (c’est-à-dire qu’en ELISA utilisant X comme Ag, sérum polyclonal du lapin 1,2 ou 3 comme Ac1, et Ac polyclonal de chèvre anti-IgG lapin-HRP en Ac2, on aurait vu un résultat positif avec lapin 1 et négatifs avec lapin 2 et 3), on peut alors doser le taux d’IgG dans un sérum de patient normal ou atteint d’un myélome à IgG de concentration inconnue en IgG à l’aide de ce sérum polyclonal du lapin 1. Dans ce cas il nous faut faire un ELISA quantitatif avec une gamme étalon établi à partir d ’une dilution sérielle d’une solution standard (commerciale) d’IgG de concentration connue, révélé par le sérum du lapin 1 plus l’Ac2 (chèvre anti-lapin-HRP) et on teste deux/trois dilutions des échantillons dont la concentration est à déterminer de manière à s’assurer que l’on sera dans la gamme.