Clonage positionnel du gène de résistance Pi33 du riz ACE1 - Pi33 AIP séquençage INRA JB Morel, D Tharreau UMR BGPI, Montpellier MH Lebrun Bioger, Grignon

Pyriculariose du riz : champignon Magnaporthe oryzae Introduction Pyriculariose du riz : champignon Magnaporthe oryzae - Principale maladie fongique du riz 5 M T pertes annuelles 2/3 marché fongicide riz Localement 100 % pertes Distribution géographique = toutes les zones de culture du riz Michel Vales, CIRAD CABI Modèle d’interaction Monocot-champignon phytopathogène CABI Hôte et agent pathogène séquencés Nombreux outils de génétique et génomique Goff et al 2002 Science ; Dean 2005 Nature ; Veneault Fourrey et Talbot 2006 Adv Appl Microbiol

Interactions riz-M. oryzae Introduction Interactions riz-M. oryzae Théorie gène pour gène Plante R/R or R/s s/s AVR Agent Pathogène vir Silué et al, 1992, Phytopathology

Les interactions plantes / agents pathogènes Gènes de Résistance des plantes Les plantes ont développées des mécanismes de défenses en réponse à l’agression d’un agent pathogènes. Dans les intéractions plantes / agents pathogènes, deux cas de figures peuvent se présenter : Développement de la maladie, dans ce cas la plante est sensible Pas de développement de la maladie, dans ce cas la plante est résistante. Une des formes de résistance bien connue dépend de la reconnaissance spécifique contrôlé par des gènes de résistances chez la plante qui sont bien caractérisés. On peut les classer, en simplifaint en deux groupes : LRR-kinases et les NBS-LRR. LRR : Leucine Rich Repeat NBS : Nucleotide Binding Site

Les interactions plantes / agents pathogènes Gènes d’avirulence fongiques Enzyme synthèse Métabolite 2aire Non Grande (>4 000 aa) ACE1 Magnaporthe oryzae   Protéines d'avirulence fongiques Taille Petite (<400 aa) Sécrétée Oui Fonction Inconnue La reconnaissance est contrôlée par des gènes d’avirulence chez l’agent pathogène, dans cette intéraction, fongique. Ces gènes sont peu connus mais présente des caractéristiques commune. Dans l’interaction riz / M.oryzae, un gène d’avirulence cloné dans l’équipe présente une originalité par rapport aux autres gènes d’avirulence. D’où la possibilité d’une intéraction originale avec le gène de résistance du riz correspondant. Interaction avec ACE1 originale ? Böhnert et al. 2004 Plant Cell ; Fudal et al. 2007 Euk. Cell

Hypothèse ACE1 Reconnaissance Pi33 Signalisation Défense OH Metabolite 2aire Pi33 Reconnaissance Signalisation Défense Fudal et al Eukaryotic Cell 2007 Böhnert et al. Plant Cell 2004

Clonage positionnel de Pi33 L’interaction ACE1-Pi33 Guy11 2/0/3::ACE1 2/0/3 Guy11ΔACE1 ACE1 cloné (MH Lebrun): - Études fonctionnelles avancées - Production du métabolite 2aire en cours Gène de résistance du riz correspondant à ACE1 est connu : Pi33 Clonage positionnel de Pi33 Etude moléculaire de l’interaction Le gène de résistance du riz correspondant à ACE1 est connu: il se nomme Pi33 Ce gène est très bla bla Et surtout la combinaison avec d’autres gènes de résistance peut conférer au riz un large spectre de résistance viq à vis de PI33. Le large spectre de résistance et de l’originalité de l’intéraction, nous conduise à aller plus loin dans l’étude de Pi33 et donc de le cloner.

Cartographie génétique et physique de Pi33 Carte génétique Variété IR64 (R) Carte physique Nipponbare Prédiction des gènes de résistance dans la zone chez Nipponbare (S) NB10 NB11 LRR Kinases NBS-LRR Pi33 a été cartographié entre 2 marqueurs distants de 0,4 cM sur une variété résistante IR64. cette zone entre ces deux marqueurs correspond à une zone de 240 Kb chez la variété modèle Nipponbare qui a été complètement séquencée mais qui n’a pas l’allèle résistant Pi33, et 9 gènes ressemblant à des gènes de résistance ont pu être prédit. Sept de ces gènes ne sont pas de bon candidats car les LRR-K ne correspondent pas aux LRR-K habituelle de résistance et des données d’expression montre que NB5 n ’est pas exprimé lors de l’infection et présente une forte homologie avec le gène correspondant à Nipponbare. 2 gènes candidats NB10 NB11. Nous avons pu couvrir cette zone avec des clones BAC de la variété résistante IR64 BAC 33 B02 et 44H23 Clones BAC d’IR64 (R) Carte physique IR64 21 gènes prédits dont 9 ressemblent à des gènes de résistances, 2 de ces gènes seraient de meilleurs candidats (fct, expression, polymorphisme). Zone de 33B02 et 44H23 analysée en priorité

Séquençage de 2 clones BACS Financements : AIP séquençage INRA + CIRAD  Séquençage « shotgun » des clones 33B02 et 44H23 3 kb HP Nuc CACTA 4 3 2 1 64 NB11 4.5 64 NB11 3.5 64 NB11 X 64 NB10 2 33B02 44H23 64 NB11 tps Tg1 64 NB10 1 31M18 IR64 (Résistant) NBS-LRR Transposons Autres Nuc 4 3 2 1 Nip NB11 Nip NB10 AP004565 Rtp Nipponbare (Sensible)

Séquençage de 2 clones BACS Financement : AIP séquençage INRA + CIRAD  Séquençage shotgun des clones 33B02 et 44H23 IR64 (Résistant) 33B02 31M18 44H23 64 NB10 1 64 NB11 X 64 NB11 tps 64 NB11 3.5 64 NB10 2 64 NB11 4.5 3 kb HP Nuc HP Nuc 1 2 3 4 NBS-LRR CACTA Tg1 CACTA Transposons Autres HP Nuc 4 3b 2 1b 93 NB11 93 NB11 tps CACTA Tg1 93 NB10 9311 (Sensible) 3 2b 1 Rtp 93 NB11b Ctg 1 Ctg 2 Ctg 3

Conséquences pour le clonage de Pi33 Clones BAC d’IR64 (R) Organisation en cluster des NBS-LRR, nb de copies variable en fct variétés de riz Chez IR64 (R), au moins 5 candidats de type NBS-LRR, Homologies de séquence importantes entre ces gènes (paralogues). Grâce aux séquences partielles des clones BACs, 5 gènes candidats de type NBS-LRR ont pu être révélé. L’homologie de séquence entre ces gènes est élevée et poser problème dans la définition d’amorces spécifiques. Nous observons aussi que ces gènes sont organisé en cluster, organisation classique des gènes de résistance. Mais le nombre de gènes au locus est variable selon la variété.

Compléter le séquençage du locus Perspectives Compléter le séquençage du locus en cours CNS Séquençage de 3 clones BAC d’IR64 Identifier et cloner le gène de résistance Pi33 - Stratégie sans a priori : Sous cloner des clones BAC et complémenter priorité : clones 33B02 et 44H23 en cours - Stratégie avec a priori (gène candidat) : Identifier Pi33 grâce à des mutants Rechercher des mutants sensibles Identifier le gène muté parmi les gènes candidats (Tilling) 2) Identifier Pi33 par complémentation des candidats Amplifier les candidats (PCR long-range) Complémenter Objectifs blabla Deux stratégies complémentaires mises en places : Sans a priori : bla bla qui a été développé dans mon mémoire mais dont je ne présenterai pas par la suite a priori blabla en cours en cours

Merci de votre attention