Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3 Sébastien Cagnol Institut de Signalisation, Biologie du Développement et Cancer CNRS UMR6543 Equipe du Dr Ellen Van Obberghen-Schilling Sous la direction du Dr Jean-Claude Chambard

La mort cellulaire programmée ou Apoptose Permet l’auto-élimination physiologique des cellules Mécanisme présent au sein de chaque cellule Conservée au cours de l’évolution

Renouvellement de certains tissus La mort cellulaire programmée ou Apoptose Au cours du développement embryonnaire Remodelage des tissus Dans l’organisme adulte A l’echelle celluliare, la mort celluliare programmée conduit à l’extinction des fonctions biologiques de la celule. Et pour tantce mécanisme est crucial pour le développement des organisme pluri à l’échelle d’un organisme La mort de nos cellules est de façon paradoxal un des mécanismes les plus important pour notre vie en tant qu’organisme pluricellulaire. La mort celluliare programmée que l’on connaît aussi sous le nom d’apoptose, est un processus conservé tout au long de l’évolution. L’apoptose est présente aussi bien dans des organismes très simples que chez les mammifères ce qui montre l’importance de ce mécanisme. Cette mort cellulaire résulte d’un programme préétabli, c’est à dire que chaque cellule possède les gènes nécessaire à la mort cellulaire et chaque cellule Le prix nobel de médecine a récompensé en 2002 les travaux sur un petit vers, le c elegans, Ces travaux ont montré que la mort cellulaire étatit Au laboratoire on s ’intéresse depuis longtemps au mécanisme de contrôle de la prolifération des cellules. Or la prolifération des cellules est étroitement associée au contrôle de la mort de ces cellules. Ainsi les cellules qui prolifèrent sont de façon paradoxale plus sensible à la mort cellulaire. La mort cellulaire programée est un processus crucial pour les organismes eucaryotes pluricellulaire. La cellule intervient de manière active dans sa propre élimination. D’ailleurs les mécanismes impliqués dans la mort cellulaire ont été conservés au long de l ’évolution. C’est un mécanisme actif d’autodestruction des cellules par fragmentation couduisant à leur phagocytoses. Mécanisme conservés au cours de l’évolution ce qui démontre son importance. Ce mécanisme est présent au sein de chaque cellule et est activable à n’importe quel moment. la mort cellulaire programmée intervient dans l ’homéostasie tout au long de la vie. Pendant le développement embryonnaire la mort cellulaire est nécessaire à la mise en place des tissus comme durant le développement du cerveau , à la formation de cavités ou encore à la perte de structures inutiles comme la perte de la nageoire caudale chez certains amphibiens/ comme lors de la maturation des organes sexuels. Dans l ’organisme adulte, la mort cellulaire est nécessaire pour maintenir une homéostasie celluliare et tissulaire en éliminant les cellules inutiles , endommagées ou potentiellement dangereuses. Par exemple lors de la maturation des cellules immunitaire les cellules autoréactives reconnaissant les antigènes du soi sont éliminées. Le mécanisme de mort cellulaire est finement régulé et tout défaut ou excès de mort cellulaire conduit à des pathologies. Par exemple la transformation tumorale est associée à la perte de fonction des mécanismes de la mort cellulaire. A l ’inverse dans les maladies neurodégénératives, l ’augmentation du niveau de mort cellulaire conduit à la perte irrémédiables des neurones. Maintien de l’homéostasie cellulaire et tissulaire Renouvellement de certains tissus

L’apoptose pathologique Excès de mort cellulaire Maladies neurodégénératives Destruction tissulaire brutale (ischémie, hépatite) Défauts de mort cellulaire Maladies Autoimmunes Cancer

caspases initiatrices Les caspases   procaspases dimérisation clivage auto-protéolytique  Famille de protéases L’etape clé dans l’induction de la mort cellulaire programmée est l’activation des caspases Les caspases initiatrices sont activées grâce à des cofacteurs qui permettent leur dimérisation. Ces caspase activatrives vont ensuit eactivées par clivages des caspase exécutrices qui vont elles même activer d’autres caspases. Ces caspases exécutrices vont ensuite cliver plusieurs substrats protéiques conduisant à l’éxecution de la mort. caspases initiatrices  caspases effectrices

Inhibition du potentiel Les caspases caspases effectrices Fragmentation de l ’ADN et du noyau Modifications du cytosquelette Inhibition du potentiel mitochondrial Réorganisation de la membrane plasmique condensation cellulaire corps apoptotiques Famille de protéases L’etape clé dans l’induction de la mort cellulaire programmée est l’activation des caspases Les caspases initiatrices sont activées grâce à des cofacteurs qui permettent leur dimérisation. Ces caspase activatrives vont ensuit eactivées par clivages des caspase exécutrices qui vont elles même activer d’autres caspases. Ces caspases exécutrices vont ensuite cliver plusieurs substrats protéiques conduisant à l’éxecution de la mort.

L’activation des caspases récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase 8 Bid cytochrome c Apaf1 caspase 8 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

La voie mitochondriale Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques mitochondrie cytochrome c Apaf1 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. procaspase 9 Apoptosome

La voie mitochondriale Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques mitochondrie cytochrome c Apaf1 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. procaspase 9 Apoptosome

La voie mitochondriale Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques mitochondrie cytochrome c Apaf1 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

Les récepteurs de mort récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase 8 DISC cytochrome c Apaf1 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

Les récepteurs de mort récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase 8 cytochrome c Apaf1 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

Les récepteurs de mort récepteurs de mort Stress cellulaire Agents antimitotiques Agents génotoxiques FADD mitochondrie procaspase 8 Bid cytochrome c Apaf1 caspase 8 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

cellules en prolifération survie apoptose Facteurs de survie matrice extracellulaire sérum Les cellules possèdent toutes une machinerie de mort cellulaire prête à être activée. Dans l’organisme adulte, il existe certains tissus qui nécessitent une activation de la mort cellulaire. Cependant, dans la plupart des ,cas les cellules doivent veiller à maintenir silencieuse la mort cellulaire. Comme les voie de mort cellulaire il existe des voies de survie cellulaire qui bloquent la mort. Ainsi chaque cellule décide en permanance de vivre ou de mourir. cellules en prolifération

Les voies de survie Survie cellulaire Croissance cellulaire Facteurs de survie Raf AMPc PI3K MEK AKT PKC MAPK Jaks NFB PKA La voie des MAPK estconstituée par un module de protéines kinase qui sont activée en cascade par phosphorylation. La première kinase activée est Raf. Chez les mamifère il y a trois isoformes de Raf , Raf-1 A-Raf et B-Raf qui ne sont pas exprimées de la même façon et qui n’ont pas la même activité kinase. Ainsi Raf-1 est exprimée dans l’ensemble des tissus alors que B-Raf est exprimée dans…. et A-Raf dans…… Au point de vue de l’activité kinase vis à vis de MEK B-raf possède l’activité kinase la plus forte viennent ensuite Raf-1 et A-Raf. Survie cellulaire Croissance cellulaire Prolifération cellulaire Différenciation cellulaire

couplés aux protéines G La voie des MAPK1/3 Récepteurs tyrosine kinase Intégrines Récepteurs couplés aux protéines G Ras Ras Raf-1 GTP GTP B-Raf P P MEK1/2 Prolifération KSR P P Différenciation MAPK1/3 Migration cellulaire La voie des MAPK estconstituée par un module de protéines kinase qui sont activée en cascade par phosphorylation. La première kinase activée est Raf. Chez les mamifère il y a trois isoformes de Raf , Raf-1 A-Raf et B-Raf qui ne sont pas exprimées de la même façon et qui n’ont pas la même activité kinase. Ainsi Raf-1 est exprimée dans l’ensemble des tissus alors que B-Raf est exprimée dans…. et A-Raf dans…… Au point de vue de l’activité kinase vis à vis de MEK B-raf possède l’activité kinase la plus forte viennent ensuite Raf-1 et A-Raf. Survie cellulaire P Substrats cytosoliques P MAPK1/3 Substrats nucléaires

Le contrôle de l’activité des MAPK Raf1 P P MEK1/2 Forme active phosphorylée P P Forme inactive déphosphorylée MAPK1/3 MAPK1/3 La voie des MAPK est en équilibre entre l’activation par les facteurs de croissance et l’inactivation par les phosphatases. Dès que l’on enlève le sérum , on coupe les signaux activateurs et l’activité phosphatase prend le dessus ce qui entraîne une inactivation des MAPK. C’est un mécanisme qui permet de maintenir l’activation du module MEK/MAPK indépendamment des récepteurs MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

L’enlèvement du sérum inhibe les MAPK tamoxifène : sérum : + - Raf1 pMAPK1/3 MAPK1 MEK1/2 Forme active phosphorylée P P Forme inactive déphosphorylée MAPK1/3 MAPK1/3 La voie des MAPK est en équilibre entre l’activation par les facteurs de croissance et l’inactivation par les phosphatases. Dès que l’on enlève le sérum , on coupe les signaux activateurs et l’activité phosphatase prend le dessus ce qui entraîne une inactivation des MAPK. C’est un mécanisme qui permet de maintenir l’activation du module MEK/MAPK indépendamment des récepteurs MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

L’activation de Raf-1:ER maintient les MAPK actives tamoxifène tam tamoxifène : + sérum : + - - Raf1 pMAPK1/3 tam P P MAPK1 ER Raf1 MEK1/2 Raf-1:ER P P MAPK1/3 MAPK1/3 La voie des MAPK est en équilibre entre l’activation par les facteurs de croissance et l’inactivation par les phosphatases. Dès que l’on enlève le sérum , on coupe les signaux activateurs et l’activité phosphatase prend le dessus ce qui entraîne une inactivation des MAPK. Dans le laboratoire nous avons un mécanisme artificiel qui permet de maintenir l’activité de la voie des MAPK indépendamment des récepteurs aux facteurs de croissance. Cil s’agit de la protéine chimérique Raf-1ER qui est composée du domaine kinase de Raf-1 et d’une partie du récepteurs aux estrogènes. L’ajout dans le milieu de culture d’estrogène ou de dérivés des estrogènes comme le tamoxifène, permet de changer la conformation de RafER induisant la dimérisation ce qui permet au domaine kinase de Raf-1 d’activer les kinases MEK et MAPK. Cette activation de la voie MAPK par RAfER est très spécifique. Nous avons pu montré que RAFER n’activait pas d’autres voies de signalisation. C’est un mécanisme qui permet de maintenir l’activation du module MEK/MAPK indépendamment des récepteurs MAPK Phosphatases (MKP 1,2,3)

Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER survie sérum apoptose contraste de phase iodure de propidium Les cellules possèdent toutes une machinerie de mort cellulaire prête à être activée. Dans l’organisme adulte, il existe certains tissus qui nécessitent une activation de la mort cellulaire. Cependant, dans la plupart des ,cas les cellules doivent veiller à maintenir silencieuse la mort cellulaire. Comme les voie de mort cellulaire il existe des voies de survie cellulaire qui bloquent la mort. Ainsi chaque cellule décide en permanance de vivre ou de mourir. + sérum

Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER tam ER Raf1 apoptose survie MAPK apoptose sérum contraste de phase iodure de propidium contraste de phase iodure de propidium Ainsi l’excès de mort cellulaire conduit à la dégénérescence des tissus comme lors des maladies neurodégénératives d’Alzheimer ou Parkinson. L’activation de Raf:ER protège les cellules CCL39 contre la mort induite par enlèvement de sérum et d’ancrage (Le Gall. MBC 00 11,1103)

La voie des MAPK inhibe l’apoptose mitochondriale CCL39 Raf-1:ER enlèvement de sérum ( h ) -sérum 24h tamoxifen (1M) : - - + 3 6 9 12 24 PARP PARP CCL 39 p-MAPK CCL 39 BclxL PARP MAPK1 BclxL mitochondrie PARP caspase 9 caspase 3 PAR P

La voie des MAPK inhibe l’activité et l’activation de caspase 9 enlèvement de sérum (h) : 6 9 14 24 tamoxifène : - - + - + - + - + procaspase 9 caspase 9 p37 p35 p-MAPK MAPK1 300 250 activité caspase 9 200 150 100 50 contrôle - sérum (14h) sérum + tam

L’apoptose mitochondriale mitochondrie tam ER Raf1 MEK1/2 cytochrome c MAPK1/3 Apaf1 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

La voie des MAPK ne bloque pas la sortie du cytochrome c contrôle - sérum (14h) - sérum + tam * cytochrome c * * caspase-3 activée * * * * dapi * *

Etude de la multimérisation d ’Apaf-1 par chromatographie d ’exclusion lysat cellulaire mAU 100 2.000 kDa 12000 443 80 60 colonne 150 669 40 200 20 Apaf1 fractions protéiques Fractions : 1 5 10 15 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. Apoptosome

La voie MAPK ne bloque pas l ’oligomérisation d ’Apaf1 (kDa) 669 443 200 r Fractions : 1 5 10 15 Apaf-1 contrôle cytochrome c Apaf-1 - sérum cytochrome c Apaf-1 - sérum + tamoxifène cytochrome c

La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome Mr (kDA) 669 443 200 150 66 Fractions : 1 10 20 30 contrôle caspase 9 - sérum caspase 9 - sérum + tamoxifène caspase 9

La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome Mr (kDA) 669 443 200 150 66 Fractions : 1 10 20 30 contrôle caspase 9 - sérum caspase 9 - sérum + tamoxifène caspase 9 1 10 1 10 1 10 Fractions de haut poids moléculaire concentrées caspase 9 contrôle - sérum - sérum + tamoxifène

L’apoptose mitochondriale mitochondrie tam ER Raf1 cytochrome c MEK1/2 MAPK1/3 Apaf1 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

La protection par Raf1:ER est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ? tam ER Raf1 P P MEK1/2 ? caspase 9 P P MAPK1/3 La voie des MAPK est en équilibre entre l’activation par les facteurs de croissance et l’inactivation par les phosphatases. Dès que l’on enlève le sérum , on coupe les signaux activateurs et l’activité phosphatase prend le dessus ce qui entraîne une inactivation des MAPK. Dans le laboratoire nous avons un mécanisme artificiel qui permet de maintenir l’activité de la voie des MAPK indépendamment des récepteurs aux facteurs de croissance. Cil s’agit de la protéine chimérique Raf-1ER qui est composée du domaine kinase de Raf-1 et d’une partie du récepteurs aux estrogènes. L’ajout dans le milieu de culture d’estrogène ou de dérivés des estrogènes comme le tamoxifène, permet de changer la conformation de RafER induisant la dimérisation ce qui permet au domaine kinase de Raf-1 d’activer les kinases MEK et MAPK. Cette activation de la voie MAPK par RAfER est très spécifique. Nous avons pu montré que RAFER n’activait pas d’autres voies de signalisation. C’est un mécanisme qui permet de maintenir l’activation du module MEK/MAPK indépendamment des récepteurs

La protection est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ? tam ER Raf1 P P U0126 MEK1/2 ? caspase 9 P P MAPK1/3 La voie des MAPK est en équilibre entre l’activation par les facteurs de croissance et l’inactivation par les phosphatases. Dès que l’on enlève le sérum , on coupe les signaux activateurs et l’activité phosphatase prend le dessus ce qui entraîne une inactivation des MAPK. Dans le laboratoire nous avons un mécanisme artificiel qui permet de maintenir l’activité de la voie des MAPK indépendamment des récepteurs aux facteurs de croissance. Cil s’agit de la protéine chimérique Raf-1ER qui est composée du domaine kinase de Raf-1 et d’une partie du récepteurs aux estrogènes. L’ajout dans le milieu de culture d’estrogène ou de dérivés des estrogènes comme le tamoxifène, permet de changer la conformation de RafER induisant la dimérisation ce qui permet au domaine kinase de Raf-1 d’activer les kinases MEK et MAPK. Cette activation de la voie MAPK par RAfER est très spécifique. Nous avons pu montré que RAFER n’activait pas d’autres voies de signalisation. C’est un mécanisme qui permet de maintenir l’activation du module MEK/MAPK indépendamment des récepteurs

L’inhibition du clivage de caspase 9 dépend de l’activité MEK +S -S -sérum (24h) + tam tam ER Raf1 U0126 (µM) : 0 0.3 1 3 10 caspase 9 U0126 MEK1/2 p-MAPK MAPK1/3 MAPK1 sérum : 5% 1% L’induction du clivage de caspase 9 est liée à la perte d’activitée des MPAk et à l’inverse la protection par activation de RafER est liée au maintien des de l’activité MAPK. Pour vérifier si ce maintien d’activité des MAPK est nécessaire à la protection nous avons utilisé un inhibiteur de la voie MAPK, le U0126, qui bloque la voie MAPK au niveau de la kinase MEK.Comme vous pouvez le constater sur cette figure, l’ajout de l’inhibiteur empêche le maintien d’activité MAPK et la protection du clivage de caspase 9. Cela démontre que l’effet protecteur de RaER est dépendant de l’activation de la voie MAPK Résultats confirmés avec deux autres inhibiteurs de MEK le PD98059 et PD184352. En utilisant l’inhibiteur U0126 sur des cellules en croissance exponentielle en présence de sérum, donc dans des conditions où la mort celluliare est bloquée, nous avons pu montré que l’inhibition de la voie des MAPK est suffisante pour induire du clivage de caspase 9. Cela démontre que l’effet protecteur du sérum dépend en partie de l’activation de la voie des MAPK. La voie des MAPK étant impliquée dans l’induction des protéines, nous avons recherché si l’effet protecteur est dépendant de la synthèse protéique. sérum U0126 : 10 3 10 apoptose MAPK caspase 9 p-MAPK

L’activité MEK est nécessaire de façon continue - sérum + tamoxifène (24hr) addition retardée de U0126 : 4 6 8 10 12 14h caspase 9 tam ER Raf1 U0126 MEK1/2 MAPK1/3

? La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ? tam ER Raf1 P P MEK1/2 P P MAPK1/3 caspase 9 La voie des MAPK est en équilibre entre l’activation par les facteurs de croissance et l’inactivation par les phosphatases. Dès que l’on enlève le sérum , on coupe les signaux activateurs et l’activité phosphatase prend le dessus ce qui entraîne une inactivation des MAPK. Dans le laboratoire nous avons un mécanisme artificiel qui permet de maintenir l’activité de la voie des MAPK indépendamment des récepteurs aux facteurs de croissance. Cil s’agit de la protéine chimérique Raf-1ER qui est composée du domaine kinase de Raf-1 et d’une partie du récepteurs aux estrogènes. L’ajout dans le milieu de culture d’estrogène ou de dérivés des estrogènes comme le tamoxifène, permet de changer la conformation de RafER induisant la dimérisation ce qui permet au domaine kinase de Raf-1 d’activer les kinases MEK et MAPK. Cette activation de la voie MAPK par RAfER est très spécifique. Nous avons pu montré que RAFER n’activait pas d’autres voies de signalisation. C’est un mécanisme qui permet de maintenir l’activation du module MEK/MAPK indépendamment des récepteurs ? protéine antiapoptotique

? La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ? tam ER Raf1 P P MEK1/2 P P MAPK1/3 caspase 9 La voie des MAPK est en équilibre entre l’activation par les facteurs de croissance et l’inactivation par les phosphatases. Dès que l’on enlève le sérum , on coupe les signaux activateurs et l’activité phosphatase prend le dessus ce qui entraîne une inactivation des MAPK. Dans le laboratoire nous avons un mécanisme artificiel qui permet de maintenir l’activité de la voie des MAPK indépendamment des récepteurs aux facteurs de croissance. Cil s’agit de la protéine chimérique Raf-1ER qui est composée du domaine kinase de Raf-1 et d’une partie du récepteurs aux estrogènes. L’ajout dans le milieu de culture d’estrogène ou de dérivés des estrogènes comme le tamoxifène, permet de changer la conformation de RafER induisant la dimérisation ce qui permet au domaine kinase de Raf-1 d’activer les kinases MEK et MAPK. Cette activation de la voie MAPK par RAfER est très spécifique. Nous avons pu montré que RAFER n’activait pas d’autres voies de signalisation. C’est un mécanisme qui permet de maintenir l’activation du module MEK/MAPK indépendamment des récepteurs ? émétine protéine antiapoptotique

L’effet protecteur de la voie MAPK dépend de la synthèse protéique - sérum + tamoxifène (24hr) addition retardée d’émétine : 2 4 6 8 h caspase 9 p-MAPK MAPK1 La voie des MAPK étant impliquée dans l’induction des protéines, nous avons recherché si l’effet protecteur est dépendant de la synthèse protéique. Pour cela nous avons en levé le sérum pendant 24h et nous avons testé l’effet d’un inhibiteur de la synthèse protéique, l’émétine, sur la protection par RafER. Comme vous pouvez le voir lorsque nous ajoutons de l’émétine en mêm temps que le tamoxifène, nous inhibns l’effet protecteur. Cela démontre que la protection est dépendante de la synthèse protéique. On peut ainsi penser que la voie des MAPK induit une protéine de survie ou permet l’accumulation d’une protéine de survie dont le temps de demie vie est court. Vous noterez aussi que l’émétine n’empêche pas le maintien d’activité de la voie MAPK et donc que la réversion de la protection n’est pas due à une inhibition de l’activtaion des MPAK par RafER. En ajoutant l’émétine de façon retardé (2 4 6 ou 8 heures après) par rapport à la stimulation au tamoxifène nous avons remarqué que l’émétine ne pouvait plus bloquer la protection après 6h de stimulation au tamoxifène. Cela indique que la sunthèse protéique est nécessaire de façon précoce, et que la ou les protéines de survie sont présentes en quantité suffisante à partir de 6h pour protéger les cellules.  L’inhibition de caspase 9 dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels

Le mécanisme de protection ne dépend pas de la phosphorylation de caspase 9 sur son résidu T125 P P MAPK1/3 P PETP N caspase 9 C 125 Allan et al, Nat Cell Biol 2003 5,647 NT - sérum tamoxifène : - - + - + caspase 9 T125A p-MAPK

Conclusions L’activation de la voie des MAPK inhibe le clivage de caspase 9 L’activation de la voie des MAPK n’empêche pas la formation de l’apoptosome L’effet protecteur dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels

Quel est le mécanisme d’inhibition ? -sérum 24h tamoxifen : - - + mitochondrie caspase 9 tam ER Raf1 XIAP P P MEK1/2 P P MAPK1/3 IAPs IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

? Rôle antiapoptotique de la voie MAPK dans les tumeurs Mutation de B-Raf ? Inactivation de l’apoptosome MAPK1/3 Développement tumoral

Le MAPK paradoxe

L’activation des MAPK induit la mort cellulaire

Stimulation de la voie des MAPK dans les cellules HEK293 Raf1-ER au sérum expo tamoxifène stimulation (min) : 5 10 30 60 5 10 30 60 p-MAPK MAPK1

L’activation prolongée des MAPK induit la mort des cellules HEK293 contrôle tamoxifène 24h tamoxifène 48h iodure de propidium

L’activation prolongée des MAPK induit l’ apoptose des cellules HEK293 50 40 30 ADN sub-G1 (%) 20 10 tamoxifène ( h ) : 24 48 72 ZVAD tamoxifène ( h ) : 0 13 18 24 30 40 48 72 tam (48h) : - + - + PARP PARP p-MAPK MAPK1

L’apoptose dépend de l’activité MEK et de la synthèse protéique CHX 1 g/mL tamoxifène 48h (1M) : - + - + - + PARP p-MAPK MAPK1 Cycloheximide (CHX) = inhibiteur de la synthèse protéique

Une protéine apoptotique est accumulée durant les premières heures 40 35 30 25 clivage de PARP (%) 20 15 10 5 tamoxifène (48h): - + + + + + 10 14 24h addition retardée de cycloheximide

L’apoptose dépend d’une activation continue de la voie MAPK 40 35 30 25 clivage de PARP (%) 20 15 10 5 tamoxifène (48h): - + + + + + 10 14 24h addition retardée de U0126 après

BclxL Crm A récepteurs de mort mitochondrie cytochrome c Apaf1 caspase 8 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices 3,6,7 procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

La mort induite par la voie MAPK dépend de la voie caspase 8 50 40 30 clivage de PARP (%) 20 10 tamoxifène (48h) : - + + + CD8 CD8 Crm A BclxL

La voie MAPK favorise l’apoptose induite par les récepteurs de mort Fas et DR4/5 20 CH11 15 TRAIL TNF Clivage de PARP (%) Fas DR4/5 TNFR 10 5 tamoxifène (28h) : - + - + - + - + ligand (14h) : CH11 TRAIL TNF

La voie MAPK augmente l’expression de FADD par un mécanisme post-transcriptionnel CH11 TRAIL tamoxifène ( h ) : 4 12 18 24 14 10 8 Fas DR4/5 FADD MAPK1 FADD caspase 8 50 40 36B4 amplification par RT-PCR 30 20 FADD contrôle 10 tamoxifène ( 24h ) 0 0.01 0.1 1 10 quantité initiale d’ARN (ng)

La mort induite par la voie MAPK ne dépend pas des récepteurs de mort CH11 siRNA GFP siRNA FADD TRAIL DN-FADD Fas DR4/5 tamoxifène (48h) : - + + + + PARP DN-FADD FADD FADD siRNA FADD DN-FADD MAPK1 caspase 8

La voie MAPK induit l’activation de caspase 8 tamoxifène ( h ) : 0 13 18 24 30 40 48 72 procaspase 8 p42 fragments clivés p28 Crm A: - tamoxifène (48h) : - + + + + IETD-fmk : - - + tamoxifène (48h) : - + + PARP caspase 8 caspase 3 active MAPK1

Conclusions partie 2 L’activation prolongée des MAPK1/3 induit l ’apoptose des cellules HEK293 L’apoptotose dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels La voie des MAPK active la caspase 8 indépendamment des récepteurs de mort La voie des MAPK augmente l’expression de FADD et favorise l ’apoptose induite par les récepteurs de mort

Perspectives partie 2 Augmentation d’expression de FADD est elle impliquée dans la régulation physiologique des récepteurs de mort ? Mécanismes d’induction post-transcriptionnelle de FADD ? Rôle dans des modèle physiologiques d ’apoptose induite par les récepteurs Fas et DR4/DR5 ? Activation de caspase 8 indépendante des récepteurs de mort Mécanismes d ’activation de caspase 8 ? Implication dans les maladies neurodégénératives ? Lien avec une activité nucléaire prolongée des MAPK ? Ce mécanisme pourrait-il servir à réactiver l’apoptose dans les tumeur à forte activité MAPK ?

Comment réconcilier les deux modèles ? Bid mitochondrie MAPK1/3 caspase 8 IL existe deux types de caspases: les caspase initatrices et les caspases exécutrices. Les caspase initaitrices comme la caspase 9 et la caspase 8 sont activée par dimérisation . Elle activent ensuite par clivage les caspase exécutrices comme les caspases 3,6,7.L ’activation des caspases initiatrices se fait par l ’intermédiaire de deux voie de signalisation: la voie mitochondriale nommée aussi voie intrinsèque et la voie des récepteurs de mort nommée voie extrinsèque. Dans . lorsque la mitochondrie reçoit des signaux de mort spécifique, elle relache dans le cytosol le cytochrome c…….oligomérisation d’Apaf1. Apaf possède un domaine de recrutement de la procaspase 9. On ne sais pas si la procaspase 9 est associée ou non en permanace à Apaf1. Ce que l’on peut dire c’est que la multimérisation d’Apaf1 permet de concentrer localement des procaspase 9 favorisant ainsi leur dimérisation et leur activation. L’autre façon d’activer les caspases est via la voie des récepteurs de mort. Ces récepteurs membranaire sont liés dans leur partie cytosolique à des protéines adaptatrices comme FADD. Ces protéines possède des domaines de recrutement de certaines caspases initaitrices comme la procaspase 8. Lorsque ces récepteurs sont stimulés par leur ligand, il se produit un changement de conformation qui rapproche entre elles les procaspases 8, permettant ainsi leur dimérisatoin et leur activation. Une fois activée, la caspase 8 va activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine Bid. Dans certaines cellules, l’activityé caspase 8 est suffisante pour activer directement les caspases exécutrices. L’ensemble Cytochrome c Apaf1 et caspase 9 forme un complexe multiprotéique nommé Apoptosome. d’un complexe multiprotéique nommé apoptosome qui permet de recruter et dimériser la procaspase 9 ce qui induit son activation. Une fois activée la caspase 9 active à son tour des caspases exécutrices, comme la caspase 3. L’autre voie d’activation des caspase est la voie des récepteurs de mort qui se trouvent à la membrane plasmique. Une fois stimulés par leur ligand les récepteurs de mort permettent la dimérisation et l’activationb de la procaspase initiatrice caspase 8. La caspase 8 peut ensuite activer la voie mitochondriale par l’intermédiaire du clivage de la protéine de mort Bid. Dans certaines conditions, l’activité caspase 8 est suffisante pour activer les caspases exécutrices. caspases effectrices procaspase 9 caspase 9 Apoptosome

Remerciements UMR 6543 INSERM U526 Dir P Auberger Equipe Ellen Van Obberghen : Etienne Boulter Jean-Claude Chambard Ivana Fantozzi Dominique Grall Anna Mansour Sylvie Maubant Samantha Sauze-Fernandez INSERM U452 Dir P Boquet Laboratoire d ’Oncophamacologie Dir: G Milano Laboratoire du Dr Véronique Paquis Dr Urszula Hibner Dr Alain Eychène Equipe Anne-Odile Hueber Equipe Gilles Pagès Equipe Jacques Pouysségur Association pour la Recherche sur le Cancer La Ligue Régionale Contre le Cancer

BIM +S -S -S+Tam +S - sérum LLNL : + ins Tam - émetine : + + Bim EL P-MapK BclXl

Le mutant Raf T481A bloque le clivage de caspase 9 - sérum U0126 : - - - + Tamoxifène : - - + + caspase 9 p-MAPK p-MEK

cellules attachées cellules en suspension tamoxifène (48h) : - + - + tamoxifène (24h) PARP p-MAPK MAPK3

L’apoptose induite par la voie des MAPK ne dépend pas du récepteur Fas 50 40 30 Clivage de PARP (%) 20 10 tamoxifène: - + + - + + + CH11: - - - - - + + DN-Fas : - - + - - - +

Morphologie des cellules HEK 293 mourantes * *