Association cuivre-radical phénoxyle: Grenoble Mardi 13 décembre 2005 Association cuivre-radical phénoxyle: chimie en solution et modèles bio-inspirés de la Galactose Oxydase Thèse préparée au sein de l’équipe de Chimie Biomimétique (L.E.D.S.S.) sous la direction du Pr. Jean-Louis PIERRE et du Dr. Fabrice THOMAS

Catalyse réactions redox Cupro-Protéines Bleues Type II Mononucléaire Activation de O2 Catalyse réactions redox Galactose Oxydase Type III Dinucléaire Activation de O2 oxygénation Catéchol Oxydase Type I Mononucléaire Transfert d’électron Cupro-Protéines Bleues Métalloenzymes à cuivre Type CuA Dinucléaire Transfert d’électron Cytochrome - C - Oxydase Autres Polynucléaire Méthane Mono-Oxygénase Ascorbate Oxydase

La Galactose Oxydase (GO): une association originale entre un métal et un radical organique

La Galactose Oxydase (GO) Isolée sous 7 états différents: Forme inactive Ar-O-Cu(II) Forme active oxydée Forme active réduite Ar-O-Cu(I) GO native . Structure cristallographique Mécanisme catalytique Avec le cuivre Pro GO Apo GO Apo GO oxydée Maturation Sans le cuivre Localisation du radical

Structure cristallographique de la forme inactive Tyr-495 Cu(II) O His-581 His-496 N N Tyr-272 O O Acétate S Cys-228 Lien covalent entre Tyr-272 et Cys-228: rôle important dans la réactivité de la forme radicalaire (forme active oxydée) Ito N., Phillips S.E.V., Yadav K.D.S., Knowles P.F., J. Mol. Biol., 1994, 238, 794

Caractéristiques UV-Vis et RPE de la forme inactive et active oxydée Forme active oxydée ►RPE (30 K, tampon phosphate): système typique d’un centre mononucléaire de Cu(II) ►UV-Vis (298 K, tampon phosphate): bandes de transfert de charge tyrosinate-Cu(II) à 438 nm et transition d-d à 625 nm ►RPE (30 K, tampon phosphate): silencieuse: couplage anti-ferromagnétique entre le spin du cuivre et du radical ►UV-Vis (298 K, tampon phosphate): bandes intenses à 445 et 800 nm attribuées aux transitions π - π * du radical

Spectre UV-Vis de la forme inactive et active oxydée Forme active oxydée: transition π - π* du radical tyrosinyle Forme inactive: bandes de transfert de charge et transitions d-d

Maturation de l’enzyme Forme active oxydée ? Maturation Pro GO Obtention de la forme active oxydée à partir de la pro-GO et de cuivre: ► Incorporation du cuivre ► Formation de la liaison covalente entre la Cys-228 et la Tyr-272 ► Formation du radical tyrosinyle couplé au cuivre ►Addition de Cu(II) en aérobie: formation lente de la forme active oxydée (t1/2 réaction = 5 h) ►Addition de Cu(I) en aérobie: formation rapide de la forme active oxydée (t1/2 réaction = 4 s) M.M.Whittaker and J.W.Whittaker J. Biol. Chem., 2003, 278, 22090

Modélisation du site actif de métalloenzymes Modèles biomimétiques - Manipulation plus aisée que l’enzyme - Relation structure moléculaire/ propriétés spectroscopiques (modèles structuraux) - Reproduire la réactivité (modèles fonctionnels) Modèles bio-inspirés - Connaître l’objet de « base » - Inspiration - Entité nouvelle avec des propriétés structurales et fonctionnelles inédites

Modélisation du site actif de la Galactose Oxydase Les complexes dérivés de ligands tripodaux de type N3O Les complexes dérivés de ligands tripodaux de type N2O2 Modélisation du site actif de la Galactose Oxydase Les complexes dérivés de triazacyclononanes (TACN) Les complexes salen

Modélisation du site actif par les complexes synthétiques: Modèles tripodaux de type N3O et N2O2 modèles tripodaux de type N2O2 modèles tripodaux de type N3O S = solvant ou contre-ion

Modèles biomimétiques de type N3O Modélisation de la tyrosine axiale et des propriétés spectroscopiques de la forme inactive Rajendra U., Viswanathan R., Palaniandavar M., Laksminarayanan M., J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1992, 3563.

Modèles biomimétiques de type N2O2 Premier modèle à la fois structural du site actif de la forme inactive et fonctionnel de la forme oxydée Thomas F, Gellon G., Gautier-Luneau I., Saint-Aman E., Pierre J. L., Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 114, 3173

Modèles bio-inspirés de type TACN et salen ► TACN: le cuivre(II) est dans un environnement pyramide à base carrée avec les phénolates systématiquement en position équatoriale ► Salen: le cuivre(II) est dans un environnement plan carré distordu vers le tétraédre Bill E., Müller J., Weyhermüller T., Wieghardt K., Inorg. Chem., 1999, 38, 5795. Thomas F., Jarjayes O., Duboc C., Philouze C., Saint-Aman E., Pierre J. L., Dalton Trans., 2004, 2662. Deux premiers systèmes bis (radical phénoxyle)-Cu(II):

Nos objectifs Association radical phénoxyle-Cu(II) - Choix structuraux - Préparation des complexes radicalaires par voie électrochimique - Sélectionner le ou les ligands conduisant à des complexes radicalaires stables Approche biomimétique de la maturation de la GO Association radical phénoxyle-Cu(II) Etendre cette association à des systèmes inédits bio-inspirés emmagasinant 3 et 4 équivalents oxydants

PLAN 1- PREPARATION DES COMPLEXES RADICALAIRES (VOIE CLASSIQUE) Choix du type de ligand Préparation et caractérisation des complexes précurseurs Préparation et caractérisation des complexes radicalaires Les complexes radicalaires les plus stables 2- MODELISATION DE LA MATURATION DE LA GO Ajout de cuivre(II) aux ligands tripodaux en présence d’une base La RMN 19F, un outil complémentaire et efficace 3- MODELES BIO INSPIRES DE LA GO Complexes bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants 4- CONCLUSION ET PERPECTIVES

Choix structuraux: ligands tripodaux de type N3O - Modifier la structure du ligand et les propriétés électroniques du phénol - Oxydation centrée sur le phénol - OMe - tBu - F - CF3 - NO2 - Benzimidazole - Benzimidazolium 6 méthylpyridine -6 fluoroquinoléine -bras méthylpyridine -bras éthylpyridine - OMe - tBu - Z = H - Z = D Synthèse de 14 ligands

Exemples de ligands synthétisés Modifications des substituants sur le phénol: Modifications autres que sur le phénol:

Structures des complexes du Cu(II) synthétisés La structure du complexe dépend du substituant en ortho du phénol: Substituant tertiobutyle: Substituant méthoxyle: Sel de Cu(II) Complexe monomère [LCu] Complexe dimère [L2Cu2] Complexe phénolate [LCu] Complexe phénol [HLCu] sans Et3N avec Et3N Obtention de 28 complexes du Cu(II)

Caractérisation des complexes monomères par diffraction des RX 2,15 Å 2,51 Å

Cas de la quinoléine fluorée: 1,90 Å Complexe phénol: arrangement « classique » Complexe phénolate: l’oxygène phénolique est en position équatoriale ; l’azote de la quinoléine est en position apicale

Caractérisation des complexes dimères par diffraction des RX Environnement de type pyramide à base carrée relativement distordue, avec les oxygènes phénoliques en position axiale

Caractérisation par spectroscopie RPE en solution gelée (100 K) Complexes monomères Complexes dimères - Transitions DMs = ± 1 avec structure hyperfine due au couplage du spin électronique avec le noyau du cuivre (I = 3/2): 4 raies - Transitions DMs = ± 1 - Transitions interdites DMs = ± 2

Caractérisation par spectroscopie UV-Vis en solution (298 K) - Complexe phénol Ar-OH---Cu: transition d-d (500-900 nm) - Complexe phénolate Ar-O---Cu: bandes de transfert de charge phénolate-Cu(II) (400-500 nm) et transition d-d

Comportement électrochimique: voltammétrie cyclique Complexes phénols Ar-OH---Cu Complexes phénolates Ar-O---Cu phénolate phénoxyle phénol phénoxonium Epa Epa Epc phénoxyle phénolate Oxydation irréversible à deux électrons centrée sur le phénol: phénol phénoxonium Oxydation réversible ou irréversible à un électron centrée sur le phénolate: Ar-O---Cu Ar-O ----Cu .+

Comportement électrochimique des complexes phénolates ► Présence de substituants électro-donneurs sur le phénolate (OMe, tBu): - systèmes réversibles - potentiels d’oxydation faibles ► Présence de substituants électro-attracteurs sur le phénolate (NO2, benzimidazole, CF3, F): - diminution de la réversibilité du système - augmentation considérable du potentiel d’oxydation ► Corrélation linéaire entre le potentiel d’oxydation Epa des complexes et sp+ de Hammett :

Complexes radical phénoxyle-Cu(II) ►Obtention: électro-oxydation au potentiel Epa des complexes phénolates monomères ou dimères à -40°C, sous gaz inerte ● Complexes monomères radicalaires: ► Caractérisation des complexes radicalaires: ● Spectroscopie UV-Vis ● Spectroscopie RPE ● Stabilité (temps de demi-vie)

Caractérisation par spectroscopie UV-Vis et RPE Spectroscopie UV-Vis (243 K) Spectroscopie RPE (4 K) Présence de bandes absorption intenses vers 400 nm et 700 nm attribuées aux transitions π–π* du radical phénoxyle Couplage ferromagnétique entre le spin du radical et celui du cuivre (S = 1): transitions interdites DMs = ± 2

Stabilité des complexes radicalaires Temps de demi-vie de 0,7 min à 230 min à 25°C Z = D Limite la dégradation par couplage radicalaire Stabilisation par des substituants électro-donneurs Peu d’influence sur la stabilisation Stabilisation par des substituants encombrants t1/2 = 230 min à 25°C t1/2 = 120 min à 25°C Bonne réactivité vis-à-vis de l’oxydation d’alcool primaire

PLAN 1- PREPARATION DES COMPLEXES RADICALAIRES Choix du ligand Préparation et caractérisation des complexes précurseurs Préparation et caractérisation des complexes radicalaires 2- MODELISATION DE LA MATURATION DE LA GO Ajout de cuivre(II) aux ligands tripodaux en solution en présence de base La RMN 19F, un outil complémentaire et efficace 3- MODELES BIO INSPIRES DE LA GO Complexes bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants

Modélisation de la maturation de l’enzyme Forme active oxydée Pro-GO ? Cuivre / O2 ligand Complexe radicalaire Expériences réalisées: ► Addition de Cu(I) au ligand, puis exposition à l’air ► Addition de Cu(II) au ligand sans base (aérobie) ► Addition de Cu(II) au ligand avec base (aérobie ou anaérobie) suivi par spectroscopie UV-Vis

Addition progressive de Cu(II) au ligand en présence de triéthylamine ► Première étape: de 0 à 1 équivalent de Cu(II) ajouté / ligand (- 40°C, CH3CN) Apparition des bandes de transfert de charge du complexe phénolate

Addition de Cu(II) en présence de triéthylamine ► Deuxième étape: de 1 à 2 équivalents de Cu(II) ajouté / ligand (- 40°C, CH3CN) Disparition des bandes de transfert de charge du complexe phénolate Apparition de bandes très intenses vers 400 nm attribuées aux transitions π-π* du radical phénoxyle Rôle oxydant du métal + Cu(II) + Cu(I) Comportement observé pour tous les ligands ayant conduit à des complexes radicalaires stables par oxydation électrochimique

Complexe phénolate 1 Cu 2+ 1 Et3N 1 Cu 2+ CH3CN CH3CN 1 Cu 2+ CH3CN Complexe phénol SANS Et3N

Optimisation du modèle: introduction d’une base endogène Choix du ligand: - Stabilise les radicaux phénoxyles sans le métal - En para : éviter d’interférer avec la complexation - Eviter la formation de dimère - Stabiliser le radical État de protonation: RMN 2D (DMSO): Séquences GHMQC et GHMBC

Complexe électro-généré Addition de Cu(II) 1 Cu (II) 1 Cu (II) (- 40°C, CH3CN) Complexe électro-généré

Comparaison Enzyme / Modèle 2 H+ -2 e- Base Oxydant + Cu(I) 1 O2 1 Et3N / Benzimidazole 1 Cu(II) H2O2 - 1 H+ - 1 e- Base Oxydant + Cu(II)

La RMN 19F: un outil original et efficace pour l’étude en solution de complexes paramagnétiques de cuivre Marquages utilisés: ►Détermination d’une constante de vitesse d’échange entre un complexe phénol et de son homologue phénolate par une expérience en température variable ► Formation du radical phénoxyle par ajout de Cu(II) à basse température

Mis en évidence de l’équilibre rapide entre les complexes phénol et phénolate dans CD3CN (Réf: C6F6) 10 d ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 d = 53,7 ppm 10 d ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 d = 49,0 ppm 100 Mélange équimolaire Equilibre proche de la coalescence à 25°C 10 d ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 d = 51,3 ppm

k + k -1 + Déterminer la constante de vitesse k par une expérience en température variable sur un mélange équimolaire des deux complexes dans CD3CN/CH3CH2CN (1/2): d = 51,3 ppm 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 d ppm

Détermination de la constante de vitesse Température 5°C -8°C -21°C -33°C -44°C Coalescence à Tc = -47°C -46°C -49°C kc = π . Dn / 21/2 k à -47°C = 3135 s-1 -59°C -65°C d = 53,7 d = 49,0 -72°C 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 d ppm

Interprétation Complexe phénol Complexe phénolate k k-1 Transfert du proton couplé au réarrangement quinoléine axiale / quinoléine équatoriale

Formation in situ du radical phénoxyle Addition Cu(II) sur le complexe phénolate et enregistrement de spectres en fonction du nombre d’équivalents de cuivre ajouté

Formation in situ du radical phénoxyle (CD3CN ; -35°C) eq Cu(II) 0.05 0.25 Cu(II) Cu(I) 0.5 0.75 d = 53,7 1 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 d ppm

PLAN 1- PREPARATION DES COMPLEXES RADICALAIRES Choix du ligand Préparation et caractérisation des complexes précurseurs Préparation et caractérisation des complexes radicalaires 2- MODELISATION DE LA MATURATION DE LA GO Ajout de cuivre(II) aux ligands tripodaux en présence de base La RMN 19F, un outil complémentaire et efficace 3- MODELES BIO-INSPIRES DE LA GO Complexes bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants

? Les différentes possibilités Emmagasiner trois équivalents oxydants: 2 possibilités ?

Ligand L dinucléant maintenu par un lien: Choix structuraux: un ligand dérivé des modèles tripodaux N3O Ligand L dinucléant maintenu par un lien: - Deux sites de complexation identiques de type N3O - Maintient de la structure par le phénol commun Groupement OMe électrodonneurs stabilisant

Synthèses et caractérisations des complexes (CH3CN) 2 Cu2+ CH3CN 1 eq Et3N 2 Cu2+ CH3CN 2 eq Et3N L m-phénolate m-phénoxyle Stot = 1 Stot = 0 -Bandes de transfert de charge m-phénolate-Cu(II) -Transitions d-d Epa Epc

Caractéristiques UV-Vis et RPE des complexes oxydés à 1 électron Transitions π-π* DMs = ± 3 Stot = 3/2 fondamental

Électro-oxydation t1/2 = 22 min à 25°C t1/2 < 20 secondes à 17°C

Conclusion générale La Galactose Oxydase: t1/2 = 120 min à 25°C ► Préparation des complexes biomimétiques radical phénoxyle-Cu(II): Voie classique: oxydation électrochimiques des complexes phénolates Influence prépondérante de R1 et R2 sur la stabilité des complexes radicalaires: STABILISATION par des substituants encombrants (ortho) et électrodonneurs (para) t1/2 = 120 min à 25°C

► Modélisation de la maturation de la GO: complexation Oxydation Modèle, a posteriori bio-inspiré, de la maturation de l’enzyme

► Extension à des modèles bio-inspirés stockant trois équivalents oxydants S = 3/2 fondamental

Perspectives ► Greffage des ligands sur support solide ► Pourquoi un deuxième équivalent de Cu(II) est-il nécessaire? ► Réactivité des complexes emmagasinant trois équivalents oxydants

Remerciements Pr. Jean-Louis PIERRE Dr. Fabrice THOMAS Dr. Sylvain HAMMAN Dr. Catherine BELLE …

+ - stop 0

Formation du lien covalent (CuI)

Formation du radical (CuI)

Formation du lien covalent et radical (CuII)

N2O2: réaction très rapide LN2O2 + CuII LCu OK 0,5 LCuII + 0,5 CuI + 0,5 L . ? ? . CuII OK LN3O + CuII LCuII LCuII + CuI OK LCuII . N2O2: réaction très rapide avec O2 CuI + L LCuI LCuII N3O: réaction lente avec O2: antidismutation avec 0,5 LCuII .

Potentiels V vs Fc+/Fc EoO2/H2O = 0,60 (eau) EoO2/H2O2 = 0,03 (eau) ECuII/CuI = ~ 0,80 (acétonitrile) 0,15 < EComplexe radicalaire/Complexe phénoate < 0,83 (acétonitrile) ELCuI/LCuII = - 0,50 (acétonitrile) EoGOox/GOinac = - 0,20 (eau) EoGOinac/GOred = - 0,40 (eau)

Pro-séquence N-terminale: A V G T G I P E G S L Q F L S L R

Glyoxale Oxydase RCHO + H2O + O2 RCO2H + H2O2