La réponse de la modélisation moléculaire Pourquoi les lipases sont-elles régiosélectives dans l'acylation de flavonoïdes ? La réponse de la modélisation moléculaire Eduardo DE OLIVEIRA Catherine HUMEAU Elaine-Rose MAIA Latifa CHEBIL Mohamed GHOUL Jean-Marc ENGASSER Séminaire Annuel RP2E -- Le 15 janvier 2009

INTRODUCTION ET OBJECTIFS

(Harvsteen, 2002 ; Boudet, 2006 ; Chebil et al., 2007) Les flavonoïdes Composés polyphénoliques à faible poids moléculaire (…) Métabolites secondaires de nombreuses espèces végétales (…)  Vaste spectre de propriétés biologiques bénéfiques, mais…  … faible solubilité en milieu hydrophile et hydrophobe. (Harvsteen, 2002 ; Boudet, 2006 ; Chebil et al., 2007)

Acylation de flavonoïdes Permet d’augmenter leur hydrophobicité (lipophilisation) Peut être accomplie par voie chimique ou enzymatique (Chebil et al., 2006, Villeneuve et al., 2007) VOIE CHIMIQUE : O-R R-O OH HO R-O O-R O-R HO OH OH HO Donneur d’acyle (R) P, T, milieu basique VOIE ENZYMATIQUE : OH HO Donneur d’acyle (R) Enzyme O-R OH HO

Cavité du site actif : « Triade catalytique » au fond Lipases ENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiques LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions : Hydrolyse de liaisons ester en milieu aqueux Formation de liaisons ester en milieu organique De nombreuses applications en biotechnologie (Jaeger, 2002) Lipase la plus utilisée : Candida antarctica lipase B (CALB) Structure de la CALB Cavité du site actif : « Triade catalytique » au fond

Deux cas d’acylation de flavonoïdes en utilisant la CALB ISOQUERCITRINE : O H O H -CO-CH3 Vinyl-acetate CALB 6’’OH (Nakajima et al., 1999 ; Stevenson et al., 2006 ; Chebil et al., 2007) QUERCÉTINE : O H OH O H OH Vinyl-acetate CALB Aucune réaction (Ardhaoui et al., 2004 ; Chebil et al., 2007)

Objectifs Utiliser des outils de SIMULATION MOLECULAIRE pour expliquer, dans le cas de l'acétylation enzymatique de l’isoquercitrine et de la quercétine, catalysée par la lipase B de Candida antarctica (CALB) : LA SPECIFICITÉ : Pourquoi la CALB est-elle capable de catalyser l’acétylation de l'isoquercitrine mais pas celle de la quercétine ? (B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ : Pourquoi, dans le cas de l'isoquercitrine, seulement un groupement hydroxyle (6’’-OH) précis du substrat réagit ?

METHODOLOGIE

Outils de simulation Structure cristallographique de l’enzyme CALB : Obtenue sur la Protein Data Bank (PDB) Code 1LBS Logiciels Discovery Studio (v.1.7) Insight (v. 2005) Champ de forces : CHARMm Algorithme de docking : LigandFit

Principe du docking Exploration de l’espace conformationnel du ligand Chaque conformation : 4 orientations possibles Chacune de ces orientations est placée dans la cavité (« pose »)

Choix de poses favorables Complémentarité géométrique : BONNE ADEQUATION DE FORME AVEC LA CAVITE Complémentarité chimique : INTERACTIONS FAVORABLES AVEC LES RESIDUS PROCHES Liaisons H Électrostatiques Aromatiques (- et -) Van der Waals (…) 15.000 conformères (= 60.000 poses) GÉNERÉES… … et seules les 50 les plus favorables RETENUES

Mécanisme réactionnel simplifié SUBSTRAT DOCKÉ H2C = CH OH CH3 Acyl-enzyme H3C CH=CH2 Vinyl-acétate (donneur d’acyle) Flavonoïde (accepteur d’acyle) F H3C F – OH Flavonoïde acylé Enzyme régénérée Enzyme libre CIBLE DE DOCKING (adapté de Uppenberg et al., 1994)

Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme L’étape critique (1) (3) (2) HO OH Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme Liaisons H entre ACE et les résidus Thr40 et Gln106 Transfert de proton (activation de l’accepteur l’acyle) Attaque nucléophile sur l’acyle-enzyme (adapté de Hult et al., 1998, 2000, 2001)

Analyse des poses retenues MODE DE LIAISON PRODUCTIF : Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction. Le substrat docké doit obéir à trois conditions : 2 ou 3 liaisons H ≤ 4Å ≤ 4Å HO OH Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme (Botta et al., 2002 ; Vallikivi et al., 2005 ; Palocci et al., 2007)

RESULTATS ET DISCUSSION

Isoquercitrine Mode de liaison 1 PARTIE SUCRE AU FOND DE LA CAVITÉ H Mode de liaison 1 PARTIE SUCRE AU FOND DE LA CAVITÉ O H PARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA CAVITÉ Mode de liaison 2

Mode de liaison 1 SUCRE AU FOND DE LA POCHE VUE 1 : VUE FRONTALE DE LA CAVITE DE L’ENZYME (SURFACE DE CONNOLLY) Val149 Ile189 Partie phénolique à l’entrée Partie sucre vers le fond + hydrophobe + hydrophile

Mode de liaison 1 SUCRE AU FOND DE LA POCHE VUE 2 : VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT Thr40 His224 Asp187 Ile189 Val149 Ser105 Gln106 ACE 3’’-OH : His224:N : 8.7 Å ACE:C : 7.4 Å 4’’-OH : His224:N : 6.2 Å ACE:C : 4.6 Å 6’’-OH : His224:N : 4.0 Å ACE:C : 3.5 Å

Mode de liaison 2 PARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA POCHE VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT Thr40 His224 Asp187 Ile189 Val149 Ser105 Gln106 ACE 5-OH : His224:N : 8.3 Å ACE:C : 5.6 Å 7-OH : His224:N : 7.1 Å ACE:C : 5.2 Å

CYCLE A AU FOND DE LA CAVITÉ CYCLE B AU FOND DE LA CAVITÉ Quercétine Mode de liaison 1 A C B CYCLE A AU FOND DE LA CAVITÉ A C B Mode de liaison 2 CYCLE B AU FOND DE LA CAVITÉ

Mode de liaison 1 CYCLE A AU FOND DE LA POCHE VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT His224 Asp187 Thr40 Ser105 Gln106 ACE 5-OH : His224:N : 6.3 Å ACE:C : 4.3 Å

Mode de liaison 2 CYCLE B AU FOND DE LA POCHE VUE 2 : VUE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT Gln157 Thr40 3’-OH : His224:N : 6.2 Å ACE:C : 5.7 Å 4’-OH : His224:N : 4.5 Å ACE:C : 3.7 Å Gln106 Ser105 ACE His224 Asp187

CONCLUSIONS

Acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre. ISOQUERCITRINE O H -CO-CH3 Acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre. OK  His224 ACE Pas d’acétylation sur la partie phénolique et… … acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre.

Pas d’acétylation sur le cycle B… QUERCÉTINE O H OH Aucune réaction OK  His224 ACE … ni sur le cycle A. Pas d’acétylation sur le cycle B…

MÉTHODOLOGIE PRÉDICTIVE ? ? ? Trois CRITÈRES STRUCTURAUX doivent être satisfaits pour qu’un complexe enzyme-substrat puisse être considéré comme RÉACTIF : 2 ou 3 liaisons H entre l’acyle-enzyme et le « oxyanion hole » Au moins un OH à ≤ 4 Å de l’atome Ace:C Au moins un OH à ≤ 4 Å de l’atome His224:N (A) LA SPECIFICITÉ : Isoquercitrine : au moins un mode de liaison satisfait aux critères de réactivité = réaction OK  Quercétine : aucun mode de liaison ne satisfait aux critères de réactivité = absence de réaction NON  (B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ : 6’’-OH : le seul OH de l’isoquercitrine satisfaisant aux critères de réactivité (donc le seul à pouvoir réagir). MÉTHODOLOGIE PRÉDICTIVE ? ? ? MODÈLES EXPÉRIENCE

 MERCI DE VOTRE ATTENTION ! Équipe Biocatalyse-Bioprocédes - LIBio – ENSAIA / INPL Eduardo Basilio DE OLIVEIRA (doctorant - 3ème année) Catherine HUMEAU (Maître de conférences) Mohamed GHOUL (Professeur) Jean-Marc ENGASSER (Professeur) Latifa CHEBIL (Maître de conférences) Évelyne RONAT (Informaticienne) Collaborateurs – experts en Modélisation Moléculaire Elaine-Rose MAIA (Professeur – Université de Brasilia – Brésil) Bernard MAIGRET (Directeur de recherche - LORIA –CNRS)  MERCI DE VOTRE ATTENTION !