Diversité et étude des métabolismes microbiens de l’arsenic d’un ancien site minier, Sainte Marie aux Mines (68) Laboratoire Interaction Ecotoxicologie Biodiversité Ecosystèmes LIEBE UMR 7146 GDR 2909: Métabolisme de l’arsenic chez les Procaryotes Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010

As (III) + soluble, + mobile, et plus toxique que l’As (V) Toxicité de l’arsenic 2 formes solubles prédominantes: As (III) ou arsénite et As (V) ou arséniate Pit Aqp As III As V SH Phosphorylation Pst As (III) + soluble, + mobile, et plus toxique que l’As (V)

Les métabolismes bactériens influencent le statut Redox de l’arsenic Métabolismes énergétiques - Réduction dissimilatrice: As (V)= accepteur final d’e- en anaérobie  gènes arr - Oxydation de l’arsenic: As (III) donneur d’e-  gènes aox/ aro/ aso Métabolismes de résistance et de tolérance - Méthylation de l’arsenic: production d’espèces généralement moins toxiques dont certaines volatiles  gènes ars M - Oxydation de l’arsenic: As (III) est oxydé en As (V)  gènes aox - Réduction expulsion: As(V) réduit en As (III) (gène ars C) puis sortie de l’As (III) par une pompe spécifique (ars B et analogues)

Métabolismes de détoxification Réduction / expulsion Oxydation Illustrations: Silver et Phung,2005

But de l’étude: Comprendre le rôle des microorganismes dans la spéciation de l’arsenic en milieu faiblement contaminé. Etude de la diversité des microorganismes capables de métaboliser l’arsenic sur le site de Sainte Marie aux Mines qui présente des conditions moins extrêmes que des sites précédemment étudiés comme Carnoulès. Hypothèse: diversité taxonomique et fonctionnelle plus élevée.

Site d’étude: Sainte Marie aux Mines, 68. pH 6,9 / Carnoulès pH ≤ 3 Concentration en arsenic dans l’eau 6 – 23 µg/L / Carnoulès 350 mg/L Concentration dans le sédiment 320 - 737 mg/kg Concentration moyenne fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg) Contamination en Aluminium (15150 mg/kg) et en Fer (23745 mg/kg)

Démarche expérimentale Prélèvement du sédiment Isolement souches cultivables Extraction ADN total Etude de la diversité taxonomique bactérienne par amplification PCR de l’ADNr 16S bactérien Etude de la diversité archéale par amplification de l’ADN r 16S archée Etude de la diversité fonctionnelle par amplification gènes aox et transporteurs

Résultats: Diversité taxonomique Diversité bactérienne des isolats cultivable Diversité bactérienne totale Diversité archéale

Diversité bactérienne des isolats cultivables 157 isolats aérobies 55 isolats anaérobies 212 isolats

Diversité bactérienne totale (248 clones séquencés) Carnoulès dominance des Betaproteobactéries (38%) et Gammaproteobactéries ( 23%) et Acidobactéries seulement 3% (Thèse Giloteaux, 2009)

Diversité archéale (83 clones séquencés) Diversité significative d’Archées A Carnoulès uniquement Euryarchaeota amplifiés à partir d’échantillons d’eau (Bruneel et al., 2008)

Résultats: Diversité fonctionnelle Répartition des gènes fonctionnels chez les isolats  Gènes de transporteurs + gènes aox Diversité totale des gènes aox  Alignement des séquences des souches cultivables + clones

Répartition des gènes fonctionnels dans les isolats Transporteurs d’arsénite Oxydation arsB- 59 isolats acr3(1)- 75 isolats acr3(2)- 11 isolats aox- 22 isolats Analyse croisée Aucun gène de résistance: 38 1 gène de résistance: 100 2 gènes de résistance: 26 3 gènes de résistance: 7 A déterminer: 41

Diversité des gènes aox Pas de gène aox affilié aux archées Pas d’aox affiliés aux Gammaproteobactéries amplifiés à partir du sédiment Présence de clones sans représentants cultivables associés Présence chez Gram + et Flavobactéries Possibilité de transferts horizontaux (souches soulignées)

Conclusion et perspectives Mise en évidence dans le milieu d’organismes capables de réduire/ oxyder l’arsenic. Recherche des gènes arr (respiration) et ars M (méthylation) Réalisation de microcosmes abiotiques ou avec un inoculum bactérien contrôlé ou naturel sous différentes conditions : Différentes phase minérale pH Statuts redox As (III)/As (V) Donneur/ Accepteur d’e-  Suivi de l’expression des gènes fonctionnels et de la spéciation de l’arsenic

Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010 Merci de votre attention Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010

Physicochimie du site: (eau et sédiments)   Water Sediments pH 6.9 - Density (Kg/l) 2.07 Moisture 20° (%) 18 Moisture 105° (%) 19.3 Fraction <2mn (%) 57.8 Fraction >2mn (%) 42.2 OM on <2mn (%) 2 P total 0.08 Al 98 µg/l 15150 µg/g As 6 µg/l 320 µg/g Cd ND 0.3 µg/g Cr 40 µg/g Cu 1 µg/l 103 µg/g Fe 23745 µg/g Mn 510 µg/g Ni 23 µg/g Pb 49 µg/g Zn 2 µg/l 88 µg/g pH (6,9) proche de la neutralité (diffère par rapport aux autres sites d’études) Concentration en arsenic faible dans l’eau (6 µg/L) et modérée dans sédiment (320 mg/kg) mais plus élevée que la concentration moyenne provenant du fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg). Contamination en Aluminium et en Fer non négligeable dans sédiments.

Résultat de diversité des gènes de transport d’arsénite Pas de gènes d’Archées amplifiés alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. ars B acr3(1) acr3(2) Séquences ars B clonées et isolats phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries Mise en évidence par clonage de nouveaux groupes sans représentants cultivables Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés. Divisé en deux clusters: Premier cluster: Actinobactéries (clones et isolats) et Gemmatimonadetes (clones). Second cluster: Bacteroidetes (isolats), Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries. Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés. Même si phylogénie respectée par rapport au 16S cas de transferts horizontaux 2 clusters: le premier associé aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones). Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes.

Diversité des gènes arsB Séquences ars B clonées proviennent des mêmes groupes que les isolats porteurs de arsB phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries Mise en évidence de nouveaux groupes sans représentants cultivables par clonage Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés. Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes

Diversité des gènes acr3(1) (1/2) Actinobactéries Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes Divisé en deux clusters: ici est représenté le premier qui comprend les Actinobactéries et les Gemmatimonadetes (clones). Transferts horizontaux à des Gammaproteobactéries, Betaproteobactéries et Flavobactéries.

Diversité des gènes acr3(1) (2/2) Second cluster, comprenant les Bacteroidetes, Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries. Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés. Cas de transferts horizontaux Phylogénie conservée par rapport au 16S. Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Bacteroidetes Verrucomicrobia Cloroflexi- Deltaproteobactéries Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes Gammaproteobactéries

Diversité des gènes acr3(2) 2 clusters: le premier composé des acr3(2) associés aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones). Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes. Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Proteobactéries Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes Verrucomicrobia