Exposition Toxico-cinétique Étapes … Toxico-dynamique

Mécanismes de cytotoxicité Génotoxicité Cycle cellulaire/ Stress oxydant Prolifération Epigénétique Signalisation Cellulaire Apoptose / Nécrose Métabolisation Santé mitochondriale Atteintes à la membrane Cytosquelettes

Étude de la Génotoxicité

Test de Mutagenèse : Test Ames (1) Developed by Bruce Ames and his colleagues in the 1970s. Tests the mutagenicity of different compounds Is used by FDA to test many chemical rapidly and inexpensively Uses special bacteria that are very sensitive to many mutagenic agents

Characteristics of mutants strains of S.typhimurium used for Ames Test cannot synthesize histidine. are very susceptible to additional mutations because they lack the normal repair mechanisms found in bacteria. more permeable than wild-type bacteria to external chemicals, including potential mutagens.

Different mutant strains of S Different mutant strains of S.typhimurium with different mutations in their DNA TA 1535 has a base substitution that produces a missense mutation in the gene coding for the first enzyme of histidine synthesis. The mutant enzyme has a proline where a leucine is in the wild-type enzyme. TA 100 is very similar to 1535, but is also supposed to detect a different range of mutagens. TA 1537 has a frameshift mutation (deletion of one nucleotide) in a different gene than is mutated in 1535. TA 1538 has a different frameshift mutation (insertion of one nucleotide) in the same gene that is mutated in TA 1537. TA 98 is similar to 1538 but is supposed to detect more mutagens than 1538 does. TA 102 is significantly different from the others. It has an ochre mutation which means that it has a nonsense mutation. This mutation occurs in the same gene as is mutated in the strain TA 1535.

Test de Mutagenèse : Test Ames (2)

Mise en évidence de la fragmentation de l’ADN sur gel d’agarose

Induction de micro-noyaux Substance génotoxique ADN Fragments chromosomiques ou isolement de chromosomes entiers Migration anormale pendant la mitose Pas d’incorporation dans les noyaux des cellules filles Condensation + Membrane Micronoyaux Visualisation par coloration spécifique et appréciation de leur taux comparé au taux de base

Induction de micro-noyaux

Induction de micro-noyaux

Induction de micro-noyaux

Vit E prévient la production de micronoyaux Prévention partielle quelle que soit la concentration en Zen

Test d’Aberrations Chromosomiques Fusions centriques Cassures

Anneaux Lacunes (Gap)

Induction d’aberrations chromosomiques Mutation Research, 365, 139-149. (2005)

Test de Comète (SCGE) Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) : Technique d’électrophorèse qui permet la détection de cassures de l’ADN (différents types de dommages) sur des cellules individualisées

 Electrophorèse: pH> 13  Neutralisation  Préparartion des lames : Inclusion des cellules dans de l’agarose sur lames de microscope Cellule individualisée  Lyse: Triton X-100, 2.5 M NaCl Nucleide; ADN compact  Déroulement de l’ADN : pH alcalin Nucleoid; ADN relaché  Electrophorèse: pH> 13 Les boucles d’ADN cassé migrent vers l’anode formant la queue de la comète  Neutralisation  Coloration de l’ADN  Microscopie à Fluorescence Analyse (100 comètes) % ADN dans la queue est liée à la fréquence des cassures La Comète

Noyau non endommagé Noyau légèrement endommagé Noyau endommagé Noyau fortement endommagé

Analayse d’image par ordinateur Longueur % ADN dans la queue (% ADN migrant) Moment (ADN migrant x Longueur)

Classe 0 Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4

DNA damage (Arbitrary units score) W. Hassen & H. Bacha / 2ème Colloque Euro-Méditerranéen 13-16 Nov. 2006