1 PHYSIOLOGIE ET EXPLORATION DE LA COAGULATION CONDITIONS D'UN BON PRELEVEMENT EN HEMOSTASE Dr. V. LE CAM-DUCHEZ 1

But de l'hémostase Limiter les pertes sanguines provoquées par une lésion vasculaire 3 étapes principales hémostase primaire = obturation de la brèche vasculaire coagulation = stabilisation de l’agrégat plaquettaire (= caillot sanguin) fibrinolyse = dégradation du caillot sanguin

Limites de l'hémostase = Hémostase Pour ne pas entraîner de caillot lorsque il n'y a pas de lésion vasculaire il existe des systèmes d'inhibition de la coagulation : l’antithrombine (AT) le système protéine C- protéines S (PC-PS) Hémostase = Activation + Inhibition - Équilibre : absence d’hémorragies ou de thromboses

Physiologie et Exploration de l'Hémostase 6 L'hémostase est le mécanisme mis en jeu pour arrêter un saignement lors d'une blessure vasculaire : elle se déroule en 3 grandes étapes : l'Hémostase Primaire la Coagulation la Fibrinolyse Pour ne pas entraîner de caillot lorsque il n'y a pas de lésion vasculaire il existe des systèmes d'inhibition de la coagulation : l'Antithrombine III le système Protéine C-Protéine S EQUILIBRE ENTRE LES DEUX 6

L'Hémostase Primaire : Physiologie (I) 7 Première étape pour arrêter une hémorragie au travers d'une plaie vasculaire Met en jeu essentiellement 3 composants : la paroi vasculaire les plaquettes le facteur Willebrand La paroi vasculaire : dans son intégrité : elle est antithrombotique dès qu'elle est lésée elle devient prothrombotique 7

La Paroi Vasculaire : Adventice Média Intima Lumière vasculaire 8 Adventice Média Cellule Endothéliale Intima Lumière vasculaire Cellule endothéliale : phénotype antithrombotique Sous endothélium : phénotype prothrombotique 8

Les Plaquettes : fragments cellulaires anucléés des mégacaryocytes 9 fragments cellulaires anucléés des mégacaryocytes contiennent différents types de granules dont les plus importants sont : les granules  les granules denses forme discoïdes ont à leur surface des glycoprotéines "de membrane" qui sont des récepteurs : les plus importantes sont : GP IbIX GP IIbIIIa 9

Morphologie des plaquettes Coloration classique MMG : GR = 7 µ - Plaquettes = 1 à 3 µ Microscopie électronique

Le Facteur von Willebrand : Glycoprotéine de PM variable : multimères faits d'un nombre variable de sous unités Synthétisé par la cellule endothéliale et stocké dedans (corps de Weibel - Pallade) mais aussi dans les plaquettes (granules ) Plusieurs rôles : intervient dans l'adhésion des plaquettes au sous endothélium sert de protéine porteuse au facteur VIII de la coagulation Taux plasmatiques très variable. 10

L'Hémostase Primaire : Physiologie (I) Adhésion des plaquettes : vW vW facteur von Willebrand GP IIbIIIa GP IbIX Fg Fibrinogène Plaquettes activées Mise à nu du sous endothélium Exposition du facteur Willebrand Fixation des plaquettes sur le facteur Willebrand grâce à la GPIbIX 11

L'Hémostase Primaire : Physiologie (II) Activation et sécrétion des plaquettes : changement de morphologie sécrétion de molécules proagrégantes : thromboxane A2 et de protéines adhésives flip-flop membranaire : exposition des PL qui lieront les facteurs de coagulation : la plaquette prend une surface pro-coagulante activation du cycle des Prostaglandines bloqué par l’aspirine

L'Hémostase Primaire : Physiologie (III) vW Fg Agrégation des plaquettes : vW facteur von Willebrand GP IIbIIIa GP IbIX Fg Fibrinogène Plaquettes activées Les plaquettes activées attirent d’autres plaquettes et les activent Les plaquettes s’accrochent les unes aux autres par le fibrinogène et grâce à la GPIIbIIIa

L'Hémostase Primaire : Exploration (I) technique du TS IVY Surgicut® Désinfecter la peau à l’éther Attendre 1 minute avant de faire l’incision 2 Gonfler le brassard à tension à 40 – 50 mmHG Déclencher le chronomètre en même temps que le dispositif d’incision 1 3 4 Récupérer le sang par capillarité sur le buvard Ne jamais toucher les bords de la plaie avec le buvard Normale < 7 min 30 12

L'Hémostase Primaire : Exploration (II) PFA 100 : Temps d’obturation : TS ex vivo Utilise des cartouches contenant une membrane recouverte de collagène puis imprégnée soit d'épinéphrine, soit d'ADP La membrane comporte une ouverture dont on va mesurer le temps d'obturation lors du passage de sang total : Normale Epinéphrine = 85 – 165 sec Normale ADP = 71 – 118 sec

L'Hémostase Primaire : Exploration (III) Le TS seul test global in vivo PFA 100® = « temps de saignement in vitro » dépiste essentiellement maladie de Willebrand et aspirine... Exploration in vitro des plaquettes: Numération sur tube EDTA voire sur tube citrate Étude des fonctions plaquettaires : mesure de l'agrégation des plaquettes temps et % d'agrégation en présence de différents activateurs des plaquettes Dosage du facteur Willebrand dosage de la molécule (Ag) dosage de son activité cofacteur de la ristocétine dosage du facteur VIII coagulant 15

L’Hémostase Primaire : Pathologies Pathologies des plaquettes : Thrombopénie Thrombopathies Maladie de Willebrand Quantitative Qualitative Se traduisent en général par allongement du temps de saignement altération des fonctions plaquettaires ± diminution du chiffre des plaquettes ± altération des dosages de facteur Willebrand 16

La Coagulation : Physiologie (I) Décrite après l’hémostase primaire, elle débute en réalité en même temps. Elle passe par deux voies : La mise à nu du sous endothélium déclenche la phase contact qui met en route la voie «intrinsèque» D’autre part la lésion de l’endothélium démasque le facteur tissulaire qui enclenche la voie «extrinsèque» Ces deux voies sont en fait concomitantes Tous les facteurs de la coagulation sont activés par clivage enzymatique puis sont transformés en enzyme qui clive un autre facteur : Notion de CASCADE DE LA COAGULATION

Les Facteurs de la Coagulation : XII VII XI IX VIII X V II fibri TCA TP Facteur tissulaire Phase contacte XIII

La Coagulation : Physiologie (II) Voie Intrinsèque Voie Extrinsèque Phase contacte XII XIIa VIIa VII Facteur Tissulaire XI XIa IX IXa VIII VIIIa Ca++ PL X Xa IIa II Ca++ PL V Va Fibrine Insoluble XIII XIIIa Fibrine Soluble Fibrinogène

La Coagulation :Exploration (I) On dispose de deux tests globaux temps de quick (TQ) ou taux de prothrombine (TP) temps de céphaline + activateur (TCA) Dosage du fibrinogène XII XI IX VIII VII II V X I

La Coagulation :Exploration (II) La suite du bilan va dépendre des résultats des tests globaux : Si le TP est diminué (sans traitement antivitamine K) Dosages des facteurs du complexe prothrombinique : II, V, VII, X fibrinogène Si le TCA est allongé (sans traitement par héparine / calciparine) Dosages des facteurs spécifiques VIII ± facteur Willebrand IX, XI, XII

La Coagulation : Pathologies Allongement du TQ : carence en vitamine K ou AVK Insuffisance Hépatique CIVD Déficit en Fibrinogène, II,V,VII ou X Allongement du TCA : Héparine ou calciparine Déficit en Fibrinogène Déficit en XI ou XII (& II,V ou X) Hémophilie A (déficit en F VIII) ou Hémophilie B (déficit en F IX) Anticoagulant circulant

Régulation de la coagulation : Inhibition 2 grands systèmes inhibiteurs de la coagulation : Le système de l’Antithrombine : La thrombine sort du caillot Elle est captée directement par l’antithrombine L’antithrombine la rend inactive Le Système protéine C – Protéine S : La thrombine circulante non captée par l’AT Se fixe sur la cellule endothéliale Elle active la PC en Pca La Pca avec un co facteur la PS va inactiver les facteurs Va et VIIIa et régulé la coagulation

La Coagulation : Amplification et Inhibition Héparine ATIII Auto-Inhibition Auto-Amplification VIIIi VIIIa VIII PS PCa Vi Va V TM IIa Xa PC IIa II IIa

Inhibition de la coagulation : Exploration & Pathologies Dosages des inhibiteurs de la Coagulations : Protéine C : Ag et Activité Protéine S : Ag (T/L) et Activité Antithrombine III : Ag et Activité Recherche de Déficits en ces protéines : Quantitatif Qualitatif Recherche d’anomalies génétiques: Sur le Facteur V : mutation LEIDEN Sur le Facteur II Toutes ces anomalies entraînent des THROMBOSES

La Fibrinolyse : Physiologie Phénomène physiologique qui aboutit à la destruction enzymatique du caillot fibrinoplaquettaire Surface de Fibfine (Fn) Plasminogène Fn Plasmine t-PA D-Dimères PAI

La Fibrinolyse : Exploration Test semi-global : Temps de lyse des Euglobulines ou Von Kaulla Dosages des différents agents de la fibrinolyse : Plasminogène PAI Dosages des produits de la fibrinolyse : PDF D-Dimères : forte valeur prédictive négative pour la thrombose

Résumé 1 plaquettes plaquettes activées Facteur Willebrand microvésicules fibrinogène GPIbVIX GPVI GPIIbIIIa

Résumé 2 XII XI VII IX + VIII X + V II XIII Fns Fns Fns Fns Fni Fni

Résumé 3 D Dimères Fni Fni D Dimères Plg Fni Plg Fni Fni Plg Fni Fni Pln Pln Fni Pln Fni D Dimères D Dimères

Conditions d'un prélèvement correct en Hémostase (I) 2 Patient à jeun depuis 3 ou 4 heures et si possible allongé Si patient hospitalisé et perfusé : ne pas prélever du coté de la perfusion +++ Si prélèvement en artériel : pas sur seringue héparinée +++ Garrot peu serré et non prolongé (< 3- 4 minutes) Ponction veineuse franche Prélèvement : d'abord un tube non hémostase (surtout si ponction difficile) mais avant les tubes sur autre antico (éviter souillure) 2

Éventuellement un tube de purge : c’est à dire réellement neutre

Conditions d'un prélèvement correct en Hémostase (II) 3 Tubes Contiennent du citrate disodique tamponné par acide citrique Doivent être remplis totalement et au moins jusqu'au trait de jauge Le rapport antico / sang = 1/9 sinon modification des temps de coagulation si polyglobulie (Hte ) : diminuer la quantité d'antico si anémie (Hte ) : augmenter la quantité d'antico Agitation par retournements successifs Etiquetage immédiatement après le prélèvement au lit du patient ++ 3

Conditions d'un prélèvement correct en Hémostase (III) 4 Les échantillons doivent être au laboratoire dans les 2 heures suivant le prélèvement : TCA 4 heures – TQ : 6 heures – Héparine : 1 heure noter de façon précise l'heure du prélèvement sur la pochette ne pas oublier l'étiquette du patient sur la pochette Notion d'URGENCE des analyses Cocher la case URGENT ne suffit pas Il faut TELEPHONER au laboratoire 4

Conditions d'un prélèvement correct en Hémostase (IV) 5 A marquer IMPERATIVEMENT sur les pochettes : TRAITEMENT ET MODALITES Nom du médicament Posologie Heure de prise ou d'injection +++ pour les HBPM Heure du prélèvement Examens demandés Si tous ces renseignements ne sont pas sur la pochette certains calculs ne sont pas faits les résultats sont ininterprétables Certains examens nécessitent un accord préalable avec le labo 5