L'INFORMATION GENETIQUE à l'échelle cellulaire

PLAN I. Support et organisation de l'IG II. Mécanismes moléculaires de conservation de l'IG III. Mécanismes moléculaires de l'expression de l'IG IV. Transmission de l'IG lors de la mitose

I. Support et organisation de l'IG A. Support moléculaire de l'IG B. Organisation fonctionnelle des génomes C. Support cellulaire de l'IG

A. Support moléculaire de l'IG : les acides nucléiques 2 approches possibles : Partir de l'observation cellulaire : des chromosomes à l'organisation moléculaire de la double hélice d'ADN Partir de l'observation moléculaire : Récupération d'ADN Hydrolyse Etude des produits d'hydrolyse Reconstitution de l'organisation moléculaire

Extraction d'ADN d'oignon

A. Support moléculaire de l'IG 1- Les acides nucléiques : des polymères de nucléotides a) Produit d'hydrolyse de l'ADN : les nucléotides 5 bases azotées principales Nucléoside = Base + sucre (pentose) Nucléotide = Base + sucre + phosphate(s)

Formes tautomériques des bases azotés : Par transfert de liaisons doubles dans les cycles "céto" (=O) à pH physiologique ou forme "énol (-OH) pour T et U "amino" (=O; NH2) ou "imino" (-OH; =N-H) pour C et G

 Associations non standard entre bases  Mésappariements  Mutations dues à erreurs de réplication de l'ADN

Fct OH réactive  molécule instable

Synthèse d'ADN à partir de dnt3P et départ de PPi

Possibilité de cyclisation interne 1-3 : AMPc

b) Autres dérivés de nucléotides remarquables : les coenzymes NAD(P), FAD , coA

c) Propriétés physicochimiques des nucléotides Propriétés acides des phosphates et charges négatives - Réactifs spécifiques : réaction de Feulgen : HCl + Schiff rose vert de méthyl acétique - Propriété : absorption de la lumière

1- Les acides nucléiques : des polymères de nucléotides 2- L'ADN, une double hélice antiparallèle a) Caractère double : association de paires de bases  Règle d'équivalence de Chargaff : Appariement A/T et G/C (1948-49) Hydrolyse chimique de l'ADN + séparation + identification  quantification des nucléotides A, T, C, G Travaille sur grand nb d'organismes Systématiquement %A=%T et %G=%C (A+G) / (T+C) = 1 Rapport (A+T)/(C+G) spécifique de l'espèce (A+T)/(C+G) = 1,52 chez l'Homme (très variable chez bactéries)

 Mise en évidence d'interactions stabilisant des empilements de bases - Spectrométrie IR : mélange G+A = somme des 2 spectres G et A calculés mélange G+C différent  G et C interagissent en solution - Loi des gaz parfaits en solution PV=nRT Nombre de particules observées par unité de volume trop faible  les bases se comportent comme des aggrégats (10 bases environ)

Appariements classique = type Watson et Crick entre bases par liaisons faibles (Hydrogène) L= 2,4 et 2,6 Å DG°' = 6 à 9 kJmol-1 (mais il existe d'autres appariements des formes tautomèriques)

A=T G C

a) Caractère double b) Structure en hélice : fluidité Mise en évidence : Diffraction aux RX (Rosalind Franklin - 1952)

Caractéristiques structurales : Watson et Crick 1953 Grand Sillon Petit Sillon

hélice A hélice B hélice Z hélice droite hélice gauche sillon : grand petit sillon : écrasé, inaccessible grand sillon : grand grand petit sillon : petit Les 2 sillons sont équivalents paires de bases inclinées de 19° par rapport au plan perpendiculaire à l'axe de l'hélice paires de bases perpendiculaires au plan de l'axe de l'hélice Liaison osidique anti Liaison osidique : purine : syn pyrimidine :anti Présence relativement fréquente Présence très fréquente Rare (dans zones alternant bases purique/pyrimidique ou avec C méthylées)

Liaisons de type Hoogsteen Autres liaisons permettant triple ou quadruple hélice (ex plasmides) Souplesse et Fluidité de l'ADN - Possibilité reploiement sur lui-même - Possibilité de passer d'une hélice type A à B à Z fct des paramètres du milieu (force ioniques ou prot). - Fluidité de l'ADN (gènes sauteurs; recombinaisons = échanges entre portions de gènes)  variabilité du génôme.

a) Caractère double b) Structure en hélice c) Hélice antiparallèle : extrémité 5'P et 3'OH Josse, Kaiser et Kornberg : - polymérisent ADN avec 4 types dnt3P dont un seul type à 32P - hydrolyse en 5'-P (transfert 32P en 3' de la base adjacente) - compare fréquence des dntP marqués en 5' par rapport à ceux marqués en 3' après hydrolyse - détermine fréquence de n'importe quel couple, sur chacun des brins de la double hélice - compare avec modèles parallèles ou antiparallèles. - Pour les 16 combinaisons, résultats toujours compatibles avec la structure antiparallèle Convention : ADN avec l'extrémité 5'P sur le brin du bas à gauche

1- Les acides nucléiques : des polymères de nucléotides 2- L'ADN, une double hélice antiparallèle 3- Les ARN : intermédiaires de l'expression de l'ADN a) Diversité des ARN Localisation nucléaire et cytoplasmique - Réactif : pyronine - Localisation : noyau + cytoplasme  Candidat comme intermédiaire entre IG nucléaire et protéines cytoplasmiques (translocation via pores nucléaires)

Diversité des propriétés physicochimiques - Certains sont solubles dans l'alcool (ARNt) d'autres associés aux membranes du REG via des protéines (ARNr) - Certains sont associés à protéines : - de manière permanente (ARNr sur sous unités ribosomiales, HnARN sur SNURPs du splicéosome par ex.) - transitoire (ARNt et ARNm sur aminoacyltransacétylase lors de traduction) - Certains sont stables (ARNt, ARNr), d'autres non (ARNm) - Certains sont gros, d'autres petits (certains HnARN de 50 nt seulement)

Approche quantitative - Globalement : dans une cellules (ex. fibroblaste), 2 à 5 fois plus d'ARN que d'ADN (10 pg d'ADN et 20 à 50 pg d'ARN) - Proportions Accumulation : ARNpré r 4% ARNr cytoplasmique 71% ARNm cytoplasmique 3% instables Hn ARN nucléaire 7% ARNt et ARN de petite taille 15% - Vitesse de synthèse  30nt/s

a) Diversité des ARN b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARN ARNr - Transcrits dans le nucléole : zone fibrillaire/granuleuse associée aux prot - ARNr peu variés (moins de 10 différents) - Structure spatiale reployée

Le nucléole, modèle de compartimentation transcriptionnelle. (A) noyau (B) détails nucléolaires : centre fibrillaire (FC), composant fibrillaire dense (DFC), composant granulaire (GC) (C) Noyau d’une cellule HeLa in vitro ; transcrits naissant en vert (Br-UTP), autres acides nucléiques rouges. (D) Modèle d’organisation spatiale de la synthèse des ARNr.

- Chez procaryotes : - 16, 23 et 5 Svedberg chez bactéries (mito 70S : 16 / 23 / 5 / 3) (CP 70S : 16 / 23 / 5 / 7 / 3) - 16S de 1542 nt +21prot (riches en Lys et arg et peu d'aromatiques) = 30S petite sous-unité (930 kDa) - 16S porte séquence de Shine et Dalgarno sur extrémité 3' OH UCCU s'associe à ARNm et permet la précision de son insertion = Ribosome Binding Site - 23S de 2904 nt + 5S de 120nt + 31protéines = 50S grosse sous-unité ribosomiale (1590 kDa)

- Chez eucaryotes : - 18 / 28 / 5 / 6 S - 18S 1800 nt + 33prot = 40S petite sous-unité (1400 kDa) - 28S 4700 nt + 5.8 S 150 nt + 5S 120 nt +49 protéines=60S grosse sous-unité (2820 kDa), ayant tous un précurseur commun - Activité des ARNr : ribozymes (nobel Altman : les enzymes ne sont pas toujours des prot.)

b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARN ARNt - solubles ds alcool - Transcrits par polymérase de type pol I - 80 nt de 200 types différents - 100 000 copies dans 1 cellule (facteur limitant de synthèse prot) - Pas associés à prot

- StructureII stable (qq heures à qq semaines) en trèfle stabilisée par triplex (association G46/C13/G22), liaisons H et forces d'empilement des bases - Structure III en L

boucle Tpsi fixe l'aminoacyltransférase boucle dihydroU fixe ribosome Fonction ACC de l'extrémité OH 3' : liaison covalente à aa boucle anticodon s'associe dans petit sous unité au codon constitué de 3 nt de l'ARNm pour mettre en correspondance un acides aminés

Maturation des ARN pré-t en ARNt

b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARN ARNm - Durée de demi-vie breve : - 2 à 5 min chez proca - 30 min ou plus chez euca - mise en évidence par Test de Monod et Jacob et Lwoff (1960) sur système inductible (utilisation du lactose par bactéries qui utilisent normalement le glucose; marquage à l'uridine tritiée pour repérer ARN néosynthétisés  Apparition d'une nouvelle enzyme (bêta galactosidase) +  Apparition d'un nouvel ARN (ni r ni t mais m) à durée de vie courte (demi vie de 2 min chez E.coli)

- ARNm en partie complémentaire de ADN - Dénaturation ADN et ARN radioactif à 85°C - Renaturation aléatoire à 60°C - Hydrolyse des ARN libres par RNase - Filtration - Résultat sur filtre = molécules d'ARN associées à ADN (protégées par association avec ADN)

- SI = SIII : chaine simple non reployée,non associée à prot - coiffe - 7mG (méthylguanosine) en 5' (lien 5'-5' par estérification de sa fonction libre ribose en 5') plus 2 nt méthylés en 2'OH. - Intérêts de la coiffe : Stabilise ARNm, protège ARNm des ribonucléases et reconnu par petite sous unité ribosomiale

Méthylations pdt ou juste après ajout de coiffe  reconnaissance par sous-unité ribosomiale

- Queue polyA en 3' (Polyadénylation) : - Transcrits par pol II qui se détache sur séquence riche en A / T. - Coupure spécifique (facteurs tissu spécifiques et intervention de SNURP) - Polymérase met 40 à 400 résidus polyA - Destruction par nucléase RNase (reconnait séquence de 10 à 1000 nt non traduite entre codon STOP et queue Poy A)

Hybride ADN / ARNm  Mise en évidence de l'épissage des introns (lors du passage dans les pores nucléaires) Maturation de l'ARN pré-m en ARN Ex. de l'ovalbumine

- Durée de vie : de plusieurs jours à moins d'une seconde (si moins de 40 A par ex.) - Modulations par protection par PABP Poly A Binding Protéines = 600 aa avec 4 domaines de liaison Nterminal à l'ARN très conservés de la levure à l'Homme. -  gènes dont ARN non polyA = histones, interféron, petits ARN nucléaires - Partie non traduite des ARNm peut se reployer en boucles  mime portions d'ADN ou ARN (= leurres à protéines) ex : ARNm des prot ribosomiales se replient et peuvent fixer les prot ribo à la place des ARNr, bloquant traduction

b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARN Hn ARN, Micro ARN et autres petits ARN non codants Heterogenus nuclear Ribonucleoparticules : 50 à 300 bases riches en U - Transcrits par ARNpol III - Participent à formation de complexes protéiques : Small NUclear RiboParticules (SNURP) et CYtoplasme RiboParticles (CYRP) - S'associent aux ARNprém lors de passage des pores nucléaires - Positionnent enzymes capables de modifier les ARNprém : soit en les méthylant (petits ARN de la famille C) soit en isomérisant U en pseudo-uridine participent donc aux mécanismes d'EPISSAGE - D'autres ont un rôle cytosolique  participent à reconnaissance par les ribosomes de la séquence signal des protéines destinées à être exportées (ds cytoplasme)

b) Propriétés structurales et fonctionnelles des ARN MicroARN - Mee 1993 Victor Ambros Anomalie du developpement de Caenorhabditis elegans MicroARN lin4 s'associe à ARNm du gène lin14 (qui assure passage stade larvaire L1  L2) MicroARN let7 s'associe sur ARNm du gène lin41 (régulant le passage L3  L4) - Transcrits par Pol II - Taille : 21 à 25 nt - Diversité : 207 identifié chez l'Homme - Plus ou moins fortement exprimés (jusqu'à 50 000 copies/ cell)

MicroARN - A partir de gènes ( 10 000 nt) non codants  priARN (en boucle à une extrémité)  Coupé par DROSHA  prémicroARN (en épingle à cheveux)  Exporté (par exportine5) ds cyto.  DICER coupe en dble brin décalé d'un nt  les 2 brins se séparent  microARN mature  Association avec prot =microNucléoRiboParticule capable de s'associer avec ARNm le dégrade (si parfaite complémentarité) l"'éteind" ss le dégrader (n'empeche pas l'association avec ribosomes ni la progression de celui-ci sur l'ARNm!)

Autres petits ARN - ARN non codant Ex : ARN 6S bactérien - Se replient en double brin  imite portion d'ADN reconnue par ARN pol  Inhibition compétitive!

A. Support moléculaire de l'IG : les acides nucléiques B. Organisation fonctionnelle des génomes 1- Le génome bactérien : circulaire