Présentation des travaux de thèse Vendredi 10 Avril 2009 LRBB Génétique et évolution des systèmes de compatibilité de croisement dans le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé Septembre 2007 – Août 2010 Pierre Abadie UMR 1202 BIOGECO Equipe de Génétique INRA Bordeaux – Aquitaine Site de Recherche de Pierroton 33612 CESTAS Co-directeurs: Pauline Garnier-Géré Antoine Kremer

Plan de l’exposé I. Présentation du sujet – Problématique Spéciation sympatrique et flux de gènes Le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé Des divergences phénotypiques Une faible divergence moléculaire    II. Croisements contrôlés inter-spécifiques Objectif et principe Le dispositif Réalisation des croisements Mesures cytologiques Résultats Perspectives III. A la recherche des gènes de spéciation Objectif Choix des GC Le cas du locus S  

Présentation du sujet – Problématique Plan de l’exposé Présentation du sujet – Problématique  

Spéciation sympatrique Spéciation sympatrique et flux de gènes Concept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants Mise en place de barrières reproductives Importance de la géographie dans les processus de spéciation: Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique (en rouge: barrières reproductives) I. Présentation du sujet – Problématique  

Spéciation sympatrique Spéciation sympatrique et flux de gènes Concept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants Mise en place de barrières reproductives Importance de la géographie dans les processus de spéciation: Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique Interaction entre flux de gènes et divergence (en rouge: barrières reproductives) I. Présentation du sujet – Problématique   5

Spéciation sympatrique et flux de gènes Différents types de barrières à l’hybridation: From Lepais 2008 (PhD) I. Présentation du sujet – Problématique  

Spéciation sympatrique et flux de gènes Comment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique? Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu : Espèce 1 Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées Alternant avec zones « perméables » aux flux de gènes Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence totale des génomes spéciation I. Présentation du sujet – Problématique  

Vision génique de la spéciation: Spéciation sympatrique et flux de gènes Comment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique? Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu : Espèce 1 Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées Alternant avec zones « perméables » aux flux de gènes Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence totale des génomes spéciation Vision génique de la spéciation: Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des espèces Ces gènes contrôlent les barrières reproductives I. Présentation du sujet – Problématique  

Vision génique de la spéciation: Spéciation sympatrique et flux de gènes Vision génique de la spéciation: Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des espèces Ces gènes contrôlent les barrières reproductives Quelques résultats en accord avec ce modèle: Savolainen & al., 2009 Nosil & al., 2009 I. Présentation du sujet – Problématique   9

Quelles en sont les bases physiologiques et moléculaires ? Spéciation sympatrique et flux de gènes - Etude de l’interaction entre les flux de gènes et la sélection divergente Quelles en sont les bases physiologiques et moléculaires ? Modèle d’étude: le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé I. Présentation du sujet – Problématique  

Le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé Chêne sessile (Quercus petraea) et chêne pédonculé (Quercus robur) Aire de répartition sympatrique: Atlas Florae Europaeae 1999 Potentiel « hotspot » d’hybridation I. Présentation du sujet – Problématique  

Un modèle de migration d’espèces Hybridation asymétrique: sessile (pollen)  pédonculé Bacilieri & al., 1996: Analyses de parenté Kleinschmit & al., 2000: Croisements contrôlés Expérience de Guy Roussel à l’INRA A la base d’un modèle de migration: of sessile Petit & al 2004 : Q. robur = espèce pionnière From Lepais 2008 (PhD) : Q. petreae = espèce en introgression

Divergences morphologiques Divergences écologiques Des divergences interspécifiques Divergences morphologiques Divergences écologiques  Types de sols Pédonculé Sessile pH Dry Wet From Lepais (PhD) Rameau & al. 1994 Kremer et al. 2002 I. Présentation du sujet – Problématique  

Une différenciation moléculaire très faible… Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs) Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3% Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique » I. Présentation du sujet – Problématique  

Ces marqueurs ont été cartographiés Une différenciation moléculaire très faible… Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs) Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3% Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique » Toutefois, forte différenciation pour quelques marqueurs Ces marqueurs ont été cartographiés Scotti-Saintagne et al., 2004 I. Présentation du sujet – Problématique  

…mais des « hotspots » de différenciation Cartographie des marqueurs: Existence de régions génomiques (~15cM) plus différenciées entre les deux espèces  En accord avec la vision génique de la spéciation proposant un modèle de génome en mosaïque structuré en régions différenciées et perméables aux flux de gènes, dans le cadre d’un processus de spéciation sympatrique Scotti-Saintagne et al., 2004 I. Présentation du sujet – Problématique  

…mais des « hotspots » de différenciation Limites des données actuelles: Etudes anciennes avec marqueurs peu informatifs Peu de données sur les fonctions des gènes dans les clusters différenciés Au final, peu de données biologiques précises sur la compatibilité de l’hybridation A quel niveau se situe ce complexe d’espèces dans le modèle de Wu ? I. Présentation du sujet – Problématique   17

Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique Stratégie de recherche Objectif général: Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique I. Présentation du sujet – Problématique  

Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique Stratégie de recherche Objectif général: Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique 2 approches parallèles: Croisements contrôlés inter-spécifiques Etude de la compatibilité d’hybridation entre différents génotypes Recherche des gènes de « spéciation » impliqués dans la divergence Approche gènes candidats Etude de la diversité moléculaire et de la différenciation I. Présentation du sujet – Problématique  

II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

Objectif et principe des croisements Etudier la compatibilité d’hybridation entre les deux espèces Principe : Caractérisation de croisements hybrides en fonction de différents génotypes Croisements dans le sens le plus favorable: sessile vers pédonculé II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

Le dispositif Parcelle expérimentale de l’INRA à Bourran (Lot-et-Garonne) 2196 individus pédonculés âgés de 7 à 10 ans Arbres « plein-frères »: Descendants F1 du croisement intra-pédonculé 3P x A4 352 génotypes, présents de 7 à 10 copies (clones) Nombreuses données disponibles sur ces arbres (taille, croissance, débourrement, etc) II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

30 arbres mères pédonculés Mélange pollinique sessile Les arbres du croisement ♀ ♂ 30 arbres mères pédonculés 10 génotypes représentatifs de la variabilité du pédigrée 3 clones par génotypes Mélange pollinique sessile 4 individus sessiles en proportion 25% de grains viables (Qs27, Qs30, Qs31, Qs32) II. Croisements contrôlés inter-spécifiques

Les arbres du croisement Localisation des arbres sur la parcelle II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 24

Les étapes des croisements Protocole mis au point à l’INRA par Guy Roussel II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 25

Les étapes des croisements L’empochage des arbres  Isoler les arbres-mères du pollen environnant II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 26

Les étapes des croisements L’empochage des arbres  Isoler les arbres-mères du pollen environnant II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 27

Les étapes des croisements Les piqûres de pollen  Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 28

Les étapes des croisements Les piqûres de pollen  Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 29

Les étapes des croisements Dépochage, mesures, prélèvements  De Mai à Septembre II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 30

Prélèvements et conservation dans le FAA Mesures cytologiques Objectif : Observation des tubes polliniques en croissance dans les styles Protocole fourni par Adrienne Ressayre Basé sur une coloration au bleu d’aniline (callose) Microscopie à fluorescence (UV) Prélèvements et conservation dans le FAA II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 31

Succès des croisements Croisements contrôlés : Variables mesurées Identification Morphologie Phénologie Succès des croisements Cytologie II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 32

Croisements contrôlés : Analyses de variance 4 modèles d’analyse de variance utilisés: « Effet génotype seul » Yij = µ + Gi + Eij Valeur moyenne effet génotype erreur « Effet génotype + bloc » Yij = µ + Gi + Bj + Eijk Valeur moyenne effet génotype effet bloc erreur « Analyse de covariance » Yik = µ + Gi + β COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur « Analyse de covariance hiérarchisée » Yik = µ + Gi + βi COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur : Effet génotype : Effet environnement II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 33

Croisements contrôlés : Analyses de variance Effet génotype significatif II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 34

 Augmentation de la puissance des tests Croisements contrôlés : Analyses de variance Nécessité de déclarer des covariables représentant les hétérogénéités de l’environnement pour mettre en évidence les effets génotypes  Augmentation de la puissance des tests II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 35

Croisements contrôlés : Analyses de variance Contribution des effets sur la somme des carrés d’écarts totaux sur la moyenne finale II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 36

Croisements contrôlés : Résultats 37

Comparaison avec les témoins naturels Plus d’inflorescences pour les arbres empochés Influence de la poche qui favoriserait la floraison? Plus de grains de pollen sur les fleurs pour les témoins naturels Plus longue exposition au pollen chez les témoins? II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 38

Comparaison avec les témoins naturels Pour la même date de prélèvement, les tubes polliniques sont plus développés chez les témoins naturels Ralentissement de la croissance des tubes Existence de barrière pré-zygotique ? II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 39

Corrélations entre variables (140) (116) (116) Relations positives, artificiellement créées ? Manque de points intermédiaires A confirmer en 2009  Augmentation des mesures Pas de conclusions possibles à ce stade II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 40

Et côté paternel ? Génotypage des glands obtenus pour déterminer le père de chaque gland 336 glands génotypés avec 12 microsatellites Pas de résultats à présenter aujourd’hui (il manque un parent) Type de résultats attendus: Objectif : Données sur de possibles différences de compatibilité selon le génotype de chêne sessile II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 41

Croisements contrôlés : Conclusions Différences significatives entre les génotypes d’arbres mères pour les variables mesurées Différences entre les génotypes pour la compatibilité d’hybridation Moins bonne croissance des tubes polliniques lors des croisements hybrides Détection de barrières pré-zygotiques A confirmer: corrélations entre variables cytologiques et « macrovariables » Détection de barrières pré-zygotiques ? II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 42

Croisements contrôlés : en 2009 Génotypage des glands Suivi des glands  Données sur barrières post-zygotiques? Les croisements et les mesures cytologiques réalisés en 2008 ont bien fonctionné et nous ont apporté des infos  Nouveaux croisements 2009 à plus grande échelle: Augmentation du nombre de croisements hybrides 19 génotypes * 3 clones 2 génotypes « ponts » Croisements intra-pédonculés Témoins empochés 10 génotypes * 1 clone Croisements intra-pédonculés Suivi de témoins naturels 19 génotypes * 3 clones Pollen sessile Pollen pédonculé Pollen naturel II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 43

Croisements contrôlés : en 2009 Suivi de 124 arbres, dont 66 empochés la semaine dernière : Merci à Guy, Benjamin, et à l’Unité Expérimentale de Bourran II. Croisements contrôlés inter-spécifiques 44

A la recherche des gènes de spéciation Plan de l’exposé A la recherche des gènes de spéciation Analyse de séquences nucléotidiques de gènes candidats   45

A la recherche des gènes de spéciation Objectif : Détection de gènes candidats potentiellement impliqués dans la divergence entre les deux espèces Principe : Analyse de séquences nucléotidiques : diversité et différenciation inter-spécifique Focalisation sur les gènes potentiellement impliqués dans les barrières à l’hybridation Détection de gènes « outliers » par rapport à une référence expérimentale « neutre » basée sur l’étude d’un grand nombre de fragments (projet de reséquençage) III. A la recherche des gènes de spéciation 46

NOMBRE D’EST SELECTIONNE Choix des gènes candidats MECHANISME GENERAL FONCTION STRATEGIE NOMBRE D’EST SELECTIONNE OK / TESTED Interspecific incompatibility pollen/pistil interaction pollen germination pollen tube growth pollen tube guidance -Keywords search in Arabidopsis, Populus and Prunus databases -Blast against own oak EST database 38 3 / 5 Flowering phase transition flowering 9 0 / 0 Strong Gst -pollen cytosqueletton -pollen glycoproteins -pollen-specific proteins -Oak genome scanning for strong Gst ESTs -Selection by function annotation 11 2 / 5 Auto-incompatibility -S locus proteins -Direct design of degenerated primers according to Prunus sequences alignements 2 0 / 2 III. A la recherche des gènes de spéciation 47

Fragments séquencés Gene Pop2: Gene Tub8: Gene H8: Précurseur d’une sous-unité de la gamma-aminobutyrate transaminase Contrôle du guidage du tube pollinique Longueur du gène chez At = 5,3kb, 13 introns 1 fragment obtenu sur 13 testés Gene Tub8: Sous unité alpha de la tubuline 8 Longueur du gène chez At = 1,8kb 2 fragments obtenus sur 4 testés Gene H8: Récepteur glycoprotéique Screené avec un fort Gst dans la banque 2 fragments obtenus sur 2 testés III. A la recherche des gènes de spéciation 48

Fragments séquencés Gene Feronia: Gene ROS: Récepteur à activité kinase exprimé dans les synergides Contrôle de l’interaction pollen-pistil chez At 3 paralogues détectés chez le chêne, 1 séquencé 1 fragment obtenu sur 4 testés Gene ROS: Récepteur exprimé dans le pollen Screené avec fort Gst dans la banque 1 fragment obtenu sur 1 testé III. A la recherche des gènes de spéciation 49

Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation 50

Reconstitution des phases avec Arlequin Calcul des statistiques Résultats: Diversité & Différenciation Reconstitution des phases avec Arlequin Algorithme ELB (Excoffier & al., 2003) POP2 : p>0,8 pour 10 individus sur 19 TUB8 : p>0,8 pour 9 individus sur 22 H8 : p>0,8 pour 8 individus sur 16 Feronia : p>0,8 pour 9 individus sur 14 ROS : p>0,8 pour 11 individus sur 14 Calcul des statistiques Fst / Nst par une AMOVA sur des matrices de distance entre les haplotypes D de Tajima Fs de Fu III. A la recherche des gènes de spéciation 51

Résultats: Diversité & Différenciation III. A la recherche des gènes de spéciation 52

Nst (2): Autre méthode dans Arlequin pour estimer le Nst Résultats: Diversité & Différenciation Nst (2) 13,5% 10,1% 14% -0.04% 12% Nst (2): Autre méthode dans Arlequin pour estimer le Nst « Locus by locus Amova » Se base sur le calcul du Fst à chaque SNP Avantage: ne dépend pas de la phase, et moins dépendant des données manquantes III. A la recherche des gènes de spéciation 53

Résultats: Diversité & Différenciation Ecarts entre Fst et Nst *** *** *** III. A la recherche des gènes de spéciation 54

Forte différenciation des locus POP2 et H8 Résultats: Diversité & Différenciation *** *** *** Forte différenciation des locus POP2 et H8 III. A la recherche des gènes de spéciation 55

Forte diversité des locus POP2 et ROS Résultats: Diversité & Différenciation *** *** *** Forte diversité des locus POP2 et ROS III. A la recherche des gènes de spéciation 56

D de Tajima < 0 pour Tub8 et Feronia Résultats: Diversité & Différenciation *** *** *** D de Tajima < 0 pour Tub8 et Feronia III. A la recherche des gènes de spéciation 57

Interprétation des tests D de Tajima < 0 pour Tub8 et Feronia Fs de Fu < 0 pour les 5 gènes Θs : estimateur de diversité basé sur le nombre de sites polymorphes Θπ : estimateur de diversité basé sur le nombre moyen de différences entre séquences (ERREUR DANS LE RAPPORT) Sous hypothèse de neutralité sélective et d’équilibre démographique, tous les estimateurs de diversité sont égaux à 4 Ne µ Ici, un D < 0 correspond à un excès de mutations rares (θs y est + sensible que θπ) S’interprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique avec K = nbre d’haplotypes attendu kobs = haplotypes observés Si kobs > K = excès d’allèles en faible fréquence  S’ est faible  Fs < 0 S’interprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique III. A la recherche des gènes de spéciation 58

A faire : estimer les taux de recombinaisons et les DL Analyse le long des fragments A faire : estimer les taux de recombinaisons et les DL III. A la recherche des gènes de spéciation 59

connu comme très différencié Analyse le long des fragments Gène entier 1,8kb Intron de 100pb connu comme très différencié (Porth & al, soumis) Gène Tub8

Analyse le long des fragments Baisse de la diversité et de la différenciation de 5’ vers 3’ Gène entier 1,8kb Intron de 100pb connu comme très différencié (Ilga Porth, comm. perso.) Gène Tub8 zone en 5’ différenciée zone fonctionnelle soumise à sélection purificatrice?

Résultats: Diversité & Différenciation L’étude de ces gènes candidats révèle des patterns de diversité et de différenciation intéressants: Diversité importante pour les gènes POP2 et ROS Forte différenciation des gènes POP2, H8 et TUB8 (10 à 16%) D de Tajima < 0 pour TUB8 et FERONIA Ce sont des gènes homologues de gènes impliqués dans les barrières aux croisements Bons candidats de gènes de « spéciation » Est-ce que ce sont des « outliers » ? III. A la recherche des gènes de spéciation 62

Recherche d’« outliers » 40000 simulations réalisées avec le logiciel FDIST2 (M. Beaumont) Détermination des quantiles 5% et 95% correspondant aux enveloppes inférieures et supérieures de la distribution des points Fst Paramètres des simulations: 2 populations 2 dèmes Fst = 3% 40000 simulations Quantile 95% Median Quantile 5% Hétérozygotie III. A la recherche des gènes de spéciation 63

Pas de gène outlier détecté avec ces simulations Recherche d’« outliers » Fst Fst des 5 gènes Hétérozygotie H des 5 gènes Pas de gène outlier détecté avec ces simulations Recherche de SNP outliers Réalisation des simulations avec d’autres logiciels (SIMCOAL) (méthodes ABC) Recherche d’outliers avec le Nst et non le Fst III. A la recherche des gènes de spéciation 64

Le locus S d’auto-incompatibilité Système gamétophytique à deux composantes (♀ S-RNase et ♂ SFB) Individus 100% hétérozygotes Association d’allèles des 2 gènes S-RNase et SFB Qu’est-ce qui se passe au niveau inter-espèces pour la différenciation génétique ? Mécanisme favorisant les croisements entre individus différents  Favorise l’hybridation ? Acquisition de données en 2009, nécessiter de passer par des étapes de clonage III. A la recherche des gènes de spéciation

Perspectives Obtention de données sur un plus grand nombre de gènes candidats Résultats du projet de reséquençage allélique (2009) Obtention de statistiques sur 300 ESTs aléatoires A utiliser comme référence neutre pour la recherche d’outliers Augmentation du nombre d’individus séquencés pour les gènes qui seront les plus intéressants III. A la recherche des gènes de spéciation

Perspectives Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ? Fst et Nst = indices de fixation Creuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs / partagés) ? 67

Aparté sur les types de polymorphismes Gène Haplotypes exclusifs Haplotypes partagés Pop2 32 1 Tub8 37 H8 16 3 Feronia 23 ROS 25 (basés sur les reconstitutions de phase d’Arlequin) Calcul d’autres paramètres pour estimer la différenciation ? Dst = absolute differentiation (Nei 1973) Gst = relative differentiation (Nei 1973) Hst = between-subpopulation heterozygosity (Aczel & Daroczy 1975; Tsallis & Brigatti 2004) Δst = between-subpopulation component of diversity, or the effective number of distinct subpopulations (Jost 2008) D = actual differentiation (Jost 2008) This is NOT the same thing as Dest. Hs/Ht = proportion intra-population heterozygosity vs total heterozygosity (Jost 2008) Δs/Δt = proportion of total diversity that is contained in the average subpopulation (Jost 2008) Jost 2008 68

Perspectives Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ? Fst et Nst = indices de fixation Creuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs / partagés) ? Développer une recherche d’outliers basée sur le Nst ou autre ? Test de type Beaumont & Nichols Réalisation d’une routine permettant de simuler des enveloppes neutres et de placer des gènes / SNPs par rapport à ces enveloppes, à partir d’entrées fasta par exemple. Utilisation de R ou de SIMCOAL Tester le sens des flux de gènes dans ce complexe d’espèces ? Méthode développée par M. Navascues (ENS Ulm), basée sur les types de polymorphismes Où se situe ce complexe d’espèces dans le processus de spéciation ? Un équilibre entre flux de gènes et sélection divergente est-il possible ? Modélisation des données dans un modèle de spéciation sympatrique Gavrilets & al., 2007 69

Merci de votre attention