VACCINS ISSUS DU GÉNIE GÉNÉTIQUE : QUELS RISQUES ?

Introduction Michel GEORGET Professeur honoraire de biologie des classes préparatoires aux grandes écoles

Virus de l’Hépatite B (HBV) et Papilloma Virus Humains (HPV) Virus à ADN bicaténaire (double brin) circulaire Les infections qu’ils provoquent sont contrôlées par le système immunitaire dans 90 à 95% des cas Ces virus ne sont pas cultivables in vitro Les vaccins sont donc issus du génie génétique Les protéines contenues dans ces vaccins sont obtenues à partir de levures ou de cellules de lignée continue (CHO ou Trichoplusia ni).

Protéines de surface Enveloppe Capside ADN bicaténaire

Les Outils du génie génétique Les enzymes Les enzymes de restriction qui reconnaissent des séquences palindromiques et coupent l’ADN bicaténaire en des points précis Les ligases qui lient de façon covalente des fragments d’ADN quelle qu’en soit l’origine les ADN polymérases qui dupliquent les molécules d’ADN Les vecteurs : dérivés d’ADN viral ou de plasmides

1/ Obtention du vecteur recombinant Exemple du GenHevac B 1/ Obtention du vecteur recombinant Principe Isoler le gène porteur de l’information L’introduire dans un vecteur (plasmide, virus) Ajouter promoteur et gènes régulateurs Nécessité d’un gène de résistance (gène marqueur) Nouveau promoteur et gènes régulateurs Cas du GenHevac B Isolement du gène S et de la séquence pré-S2 Plasmide d’Escherichia coli (pBR 322) Promoteur et séquences régulatrices du virus SV40 Gène dhfr (dihydrofolate réductase) Promoteur du virus MMTV + séquences régulatrices du SV40

Gène S Plasmide bactérien Première ouverture Gène S Promoteur du SV40

Gène S Promoteur du SV40 Fermeture

Gène de résistance (dhfr) Seconde ouverture Gène S Promoteur du SV40 Gène de résistance (dhfr) Promoteur MMTV Gène de résistance (dhfr) Promoteur MMTV

Plasmide recombiné final Gène S Promoteur du SV40 Promoteur MMTV Gène de résistance (dhfr)

2/ Transfection des cellules et expression du gène d’intérêt (gène viral) Principe Transfection dans un système cellulaire Tri des cellules transfectées Expression du gène d’intérêt Purification Cas du GenHevac B Transfection dans cellules de lignée continue CHO Traitement par méthotrexate Synthèse de la protéine HBs Purification

Cellules CHO Transfection Plasmides recombinés

Cellule survivante capable de produire la molécule HBs Traitement des cellules au Méthotrexate : Sélection des cellules transfectées Plasmides recombinés Cellules CHO

Quelques différences entre les vaccins HB GenHevac B - Protéine HBs avec séquence pré-S2 Production par cellules de lignée continue CHO HBs glycosylée - Excrétion des protéines par les cellules Engerix et HB Vax DNA - Protéine HBs sans séquence pré-S2 Production par cellules de levure (Saccharomyces cerevisiae) HBs non glycosylée - Protéines non excrétées broyage indispensable

Fabrication des vaccins anti-HPV Les vaccins contre les papillomavirus sont fabriqués à partir de la protéine de surface L1 de chacun des papillomavirus choisis pour chaque vaccin. Ces protéines, obtenues par génie génétique, ont la propriété de s’auto-assembler en particules vides ressemblant aux virus (Virus Like Particles ou VPL) mais sans information génétique.

Les étapes de la fabrication Isoler les gènes responsables de la synthèse des protéines d’enveloppe (L1) de ces virus. Insertion de ces gènes dans un vecteur Infecter les cultures cellulaires par ce vecteur Recueillir les protéines fabriquées par les cultures cellulaires et les purifier Ces protéines (sous réserve qu’elles soient produites par des cellules eucaryotes) s’associent en pentamères, lesquels s’assemblent pour constituer des particules vides ressemblant aux virus (VLP)

Deux vaccins se partagent le marché Le vaccin GARDASIL® (Merck) : est un vaccin quadrivalent constitué de 4 types de VLP comportant les protéines L1 des types 6, 11, 16 et 18 obtenues à partir de cultures de levures (Saccharomyces cerevisiae). Il est adjuvanté par de l'hydroxyphosphate d'aluminium (Al: 225 μg). Le vaccin CERVARIX ® (GSK) : vaccin bivalent dirigé contre les HPV 16 et 18. Les protéines L1 sont obtenues par infection de cellules d’insectes Hi-5 Rix4446 dérivées de Trichoplusia ni (Lépidoptère) par un baculovirus ayant intégré le gène correspondant. Il contient un nouvel adjuvant (ASO4) qui renferme 500 g d’aluminium et 50 g de lipide monophosphoryl lipid A (MPL).