Rôle de la clustérine dans la neuroprotection Maître de Stage : Y.Charnay Collaborateurs : C.Bourras, E.Kovari, P.Vallet, M.Mailov Mots Clés : Clustérine, Neuroprotection, Ischémie cérébrale, Accidents cardiaux vasculaires, Maladie dAlzheimer, Pichia Pastoris. Techniques : Electrophorèse, Western Blot, Immunohistochimie (HRP), PCR, Dialyse, Purification, invalidation d'un gène (K.O). Représentation schématique de la structure de la clustérine humaine. En haut, le précurseur contenant une séquence signal (magenta) ainsi que les résidus qui formeront les chaînes α (orange) et β (bleu clair). En bas, les chaînes α et β assemblées antiparallèlement et formant un hétérodimère. Il y a des régions riches en cystéine (rouge). Ainsi que 2 régions α Hélices coiled-coil (vert) et 3 régions amphipatiques (bleu foncé). Introduction : De nombreuses études ont mis en évidence le rôle central de la clustérine dans la protection contre la mort cellulaire neuronale. Le but de ce stage, essentiellement basé sur lapprentissage des techniques de laboratoire, est de continuer la production de souris knock-out (Clu - / - ) et de visualiser les effets de cette transformation génétique. En outre, lautre aspect du stage concerne la production de clustérine et sa purification.. A plus long terme le but est dinjecter de la clustérine afin de combler le déficit. A partir de lARN de souris et après RT- PCR, nous allons insérer lADN de la clustérine dans un plasmide sous la dépendance du promoteur AOX1 (activé par le méthanol) et en présence de lα-factor (permet lexpression de la clustérine hors de la levure). Ce plasmide contient aussi une résistance à la Blasticidine. Afin damplifier notre vecteur nous le transférons dans Pichia Pastoris. Cette levure peut produire la clustérine directement dans le milieu de culture. Après avoir laissé pousser pendant quelques jours nos levures modifiées dans le milieu de culture, nous les remettons dans un milieu neuf mais nous remplaçons le glycérol ( source de carbone) par du méthanol. Ceci induit la production de clustérine. On obtient 2.8 mg de clustérine. A partir du sérum, on peut lire le génotype sur les gels PAGE alors quà partir du sang complet et après PCR la clustérine nest pas amplifiée. Il ny a pas de signe objectif ou comportemental qui nous permettrait de distinguer les souris WT des Clu - / -. On leur posera donc des inductances sous cutanées qui nous permettrons de les différencier. A plus long terme, le but de ces travaux est dinjecter la clustérine sur des souris ayant subit une ischémie cérébrale et den observer les effets. Les accidents cardiaux vasculaires ( par an) et la maladie dAlzheimer ( cas en France) sont les pathologies où la clustérine pourra agir efficacement. R.SAINZ Mai - Juin 2005 © Seule la clustérine va rester fixée à la colonne. Ceci est dû à laffinité de lhistidine envers les ions nickel présent sur la colonne. Grâce à un dosage colorimétrique (BCA), on sélectionne les tubes où la densité optique est la meilleure. On réalise une dialyse afin de parfaire la purification.