Infections virales et transplantations LE CLUB DE LA TRANSPLANTATION Infections virales et transplantations 6 et 7 Octobre 2005

S. ALAIN, CHU Dupuytren, Limoges RESISTANCE DU CYTOMEGALOVIRUS AUX ANTIVIRAUX APRES TRANSPLANTATION S. ALAIN, CHU Dupuytren, Limoges

Le Cytomégalovirus Virus de la famille des Herpesviridae Ubiquitaire Persiste sous forme latente après la primo-infection

La physiopathologie de l’infection favorise l’émergence de résistances

L’infection à CMV Infection symptomatique après transplantation d’organe solide Rein-pancréas : 50% Cœur-poumon : 39-41% Foie et pancréas : 22-29% Cœur et rein : 8-35% Résistance aux antiviraux après transplantation : 0-13% L’infection à CMV peut-être symptomatique, allant du syndrome CMV à la maladie à CMV touchant un ou plusieurs organes, ou asymptomatique uniquement détectable par les techniques virologiques PCR, antigénémie, culture

La résistance du CMV aux antiviraux, essentiellement au GCV, après transplantation est préoccupante à plus d’un titre : Elle augmente la fréquence des épisodes de virémie, symptomatiques ou non, Elle accélère le développement de la maladie à CMV, Elle favorise le rejet de greffe Elle augmente la mortalité. (Bhorade et al., J. Heart Lung Transpl., 2002) Elles sont difficiles à estimer, variant en fonction du degré d’immunosuppression mais aussi du type de mutant résistant et des possibilités thérapeutiques.

Qu ’appelle-t-on résistance au traitement? La persistance d ’une réplication virale sous traitement bien conduit définit la résistance clinique Causes pharmacologiques/immunologiques/virologiques La mise en évidence d ’une souche résistante par l ’étude du phénotype ou du génotype définit la résistance virologique La résistance clinique peut aller de la simple excrétion d’un virus résistant à la maladie à CMV résistante au traitement. La surveillance virologique permet de suspecter la résistance virologique avant la résistance clinique devant la persistance d’une réplication virale

Comment aborder l ’étude des résistances? Quels en sont les mécanismes moléculaires ? Comment émerge une souche résistante ? Quand et Comment la rechercher ? Que représentent les résistances en transplantation d ’organe ? Quelles conduites peut-on proposer ?

Mécanismes moléculaires de résistance du CMV aux antiviraux

Les molécules antivirales disponibles inhibent l’ADN polymérase virale Ganciclovir GCV Cidofovir CDV Foscarnet PFA UL97 GCV-P Kinases cellulaires GCV-PP CDV-P Ces molécules sont sans effet sur le virus latent elles sont virustatiques PFA GCV-PPP CDV-PP ADN polymérase UL54

Prodrogues : ACV Val-ACV GCV Val-GCV UL97 ACV-PP ACV-PPP GCV-PP Valaciclovir Aciclovir L-Valine UL97 ACV-PP ACV-PPP GCV-PP GCV-PPP ADN polymérase UL54

Association de résistances Ganciclovir Cidofovir Foscarnet Mutation Mutation UL54 UL97 Modes de résistance du CMV aux antiviraux Résistance au cidofovir Et Au ganciclovir Résistance isolée au ganciclovir Par défaut de phosphorylation Résistance au foscarnet Résistance croisée Association de résistances

Cycle intracellulaire du CMV 8 9 pp65 IE72 IE E L 2 3 4 5 6 UL54 gB, gH 1 7 UL97, UL27 pp65 Thiourée, Leflunomide GCV, CDV, FOS : inhibiteurs de UL54 Benzimidazolés : BDCRB, TCRB : inhibiteurs des terminases Maribavir (indolocarbazole) : inhibiteur de la sortie du noyau/tégumentation EGFr Terminases

Site d’action des antiviraux 7 8 9 UL97, UL27 gB, gH 1 pp65 IE72 3 5 2 Maribavir Thiourée, Leflunomide GCV, CDV, FOS : inhibiteurs de UL54 Benzimidazolés : BDCRB, TCRB : inhibiteurs des terminases Maribavir (indolocarbazole) : inhibiteur de la sortie du noyau/tégumentation EGFr Benzimidazolés Terminases 6 4 GCV, CDV, FOS UL54 IE E L

UL97 Sérine-thréonine Kinase de 707 aa, 78KDa Activée par autophosphorylation Indispensable à la sortie des particules virales hors du noyau Substrat naturel inconnu Phosphoryle accessoirement le GCV maribavir, avec UL27

Localisation des principales substitutions d'acides aminés responsables de la résistance au ganciclovir dans la phosphotransférase UL97 : I II III IV V VI VII VIII IX X XI NH2 COOH 520 594 595 460 601 659 603 665 606-607 590-592 594-599 397 205 Domaine catalytique, sites d’autophosphorylation Nombreuses délétions de 1 à 17 codons dans la région 590-607 397 : mutation de résistance au maribavir D 205E : mutation compensant partiellement la résistance liée aux mutations 460 (?) et 594 Plus de 70 % des mutations de résistance connues sont situées entre les acides aminés 460 et 607

UL54 ADN Polymérase ADN dépendante, 140KDa, 3 ’->5 ’ exonucléase Associée à une protéine accessoire UL44 Assure la réplication du génome viral

Localisation des principales substitutions d ’acide aminé responsables de résistance dans UL54 Résistance au cidofovir : Résistance au ganciclovir et au cidofovir : Résistance au foscarnet Résistance au ganciclovir et au foscarnet : Exo I Exo II Exo III NH2 IV -region C II VI III I VII V COOH Les mutations sont réparties sur la totalité du gène Avec un regroupement dans des domainesfonctionnels conservés conservés 301 408 495 410 412 413 419 415 501 545 503 513 516 522 588 722 756 781 787 802 805 809 812 821 D981-982 987

Quels sont les mécanismes d’émergence d’une souche résistante?

Réplication virale => mutations+/-favorables Sélection Avant traitement Traitement Après traitement Souche sauvage (Cycle viral normal) Souches mutantes Blocage du cycle viral des souches sensibles Prédominance de la souche résistante Prédominance de la souche sauvage Réplication virale => mutations+/-favorables Sélection

Influence des mutations sur la sélection des résistances Les mutations de UL97 sont les premières à apparaître Elles confèrent un niveau de résistance modéré au GCV (CI50 < 30) Diminuent peu ou pas la capacité réplicative du virus mutant Les mutations de UL54 apparaissent plus tardivement Elles confèrent un niveau de résistance élevé Mais diminuent la capacité réplicative du virus

Influence des mutations de UL54 sur la capacité réplicative du virus La capacité réplicative du virus peut être mesurée par la quantification du virus produit en culture ou par la mesure de l’activité polymérasique de l’ADN polymérase de la souche, produite in vitro. (Springer et al., J Clin Microbiol, 2005) (Ducancelle et al., J Clin Virol., 1999)

Emergence d ’une souche résistante in vivo Emery, J exp.Med., 1999; J. clin. Virol, 2001 Copies/ml Cinétique virale au cours d ’une infection à CMV non traitée : temps de doublement de la population 1 à 2 jours Décroissance virale sous traitement : 1/2 vie 1 à 2 jours Emergence du mutant : La souche mutée préexiste au traitement, devient dominante sous traitement puis redevient indétectable à l ’arrêt du traitement Décroissance de la charge virale en dessous du seuil de détection (200copies/ml de sang) en 21 jours sous traitement 200copies/ml 21j T Traitement Mutant Sauvage En compétition

Quels sont les facteurs de risque de résistance Quels sont les facteurs de risque de résistance? Existe-t-il des facteurs prédictifs ?

Emergence d’ une souche résistante : Facteurs de risque après transplantation d’organe (1) Statut sérologique D+/R- Utilisation d’anticorps anti-lymphocytes (SAL) Transplantation pulmonaire ou rein-pancréas Réplication virale intense Charge virale élevée (Nle : 4-6 log) Augmentation rapide de la virémie Episodes répétés de maladie à CMV Administration prolongée d’antiviral (prophylaxie > TT anticipé) Concentration plasmatiques suboptimales de l’antiviral au site de l’infection Mauvaise biodisponibilité (GCV oral) Toxicité nécessitant des réductions de dose Tous les facteurs favorisant la réplication du CMV se retrouvent dans les facteurs favorisants l’émergence de résistance. Ainsi, d’après l’étude de Limaye et al. 2002, Le statut sérologique D+/R_, le nombre de récurrences d’infection à CMV, l’utilisation d’agents anti-lymphocytes, un fort pic de charge virale, ainsi qu’une exposition prolongée au traitement sont significativement associés au risque de résistance. La souche résistante peut rester confinée au site de l’infection et ne pas être détectable dans la circulation générale Après prophylaxie (Humar 2005) pas d’association entre anti-lymphocytes et infection à l’arrêt de la prophylaxie, alors que l’ association avec le statut sérologique persiste.

Facteurs de Risque de résistance (2) Absence d’association entre génotype gB CMV et maladie à CMV ou résistance

La charge virale circulante permet-elle de prédire l’émergence de résistance après transplantation ? Sous traitement : Disparition de l’antigénémie en 10 à 15 jours Négativation de la PCR en 15-21 jours Valeur prédictive de la pente de décroissance ? Le temps nécessaire pour diminuer de moitié la quantité de CMV mesurée dans le sang est de 1,5 à 2 jours selon les patients. La décroissance est modifiée par l’apparition de souches résistantes au traitement Emery et al., 2001

La décroissance virale sous traitement lors du premier épisode d’infection à CMV est prédictive des récurrences, en l’absence de résistance Humar et al., JID, 186, 2002 Exemples : Patients 1 et 2 : pas de récurrence ; Patients 3 et 4 : récurrences 52 patients prophylaxie par GCV oral ou IV 12sem Premier épisode de maladie à CMV (syndrome CMV et/ou atteinte d’un organe) : surveillance virologique rapprochée (hebdomadaire) Cependant récurrence n’est pas synonyme de résistance (Boivin 2001 : 1/12) TT GCV IV 10mg/kg/j 2 à 3 semaines

FDR de récurrence Environ 60 jours après le premier épisode de maladie à CMV (ganciclovir et valaciclovir) Absence de clearance virale à l’issue du premier traitement p<0,001 Augmentation du délai de clearance virale 17,2js ->33,8

Quand craindre l’émergence d’une souche résistante? Devant une augmentation ou une persistance de la charge virale (PCR ou antigénémie) sous traitement à dose efficace chez un patient ayant été exposé de façon prolongée à un antiviral (prophylaxie ou traitements répétés) Ce d’autant que ce patient présente d’autres facteurs de risque de résistance La réponse retardée au traitement ne traduit pas systématiquement une résistance, mais représente un facteur de risque de récurrence, à surveiller. L’élévation de l’antigénémie dans les 2 premières semaines d’un traitement est possible. Elle n’est pas associée à une résistance. (Gerna et al., JID 2003; Nichols et al., Blood 2001)

Comment mettre en évidence une souche résistante ?

Méthodes de détection des résistances Phénotype : Définit la concentration inhibitrice 50% et 90% de l ’antiviral testé Nécessite l ’isolement du virus en culture cellulaire Long et difficile à standardiser Etudie le comportement du virus quel que soit l ’antiviral ou les mutations (nouveaux antiviraux) Foyer de Cellules infectées

Mesure des CI50 et CI90 sur virus titré Afin de standardiser les mesures on utilise un index de sensibilité, en référence à une souche sensible de référence ou au résultat d’un panel d’isolats sensibles testés au laboratoire Interprétation du phénotype : CI50 du virus testé ------------------------- = IS50 > 3 CI50 souche sensible de référence

Mesure en échiquier Antagonisme-indifférence-synergie Concentrations de foscarnet M 0 100 200 400 Concentrations de ganciclovir en M Maribavir : effet synergique avec le cidofovir, additif avec les autres molécules

Méthodes de détection des résistances Génotype : Recherche les mutations de résistance dans un gène donné : UL97 ou UL54 Directement dans le prélèvement Plus sensible que le phénotype Permet la détection de mutations nouvelles Non standardisé pour le CMV : Absence de banque de données sur les mutations de résistances Sensibilité variable des méthodes de génotypages : de 10% à 50% Amplification par PCR RFLP séquence Rapide non exhaustif Interprétation Du génotype

Corrélation génotype-phénotype La mise en évidence d’une mutation connue est corrélée à la résistance clinique et phénotypique Lorsqu’une nouvelle mutation est observée, sa responsabilité dans la résistance doit être démontrée Par étude du phénotype des souches mutées Par transfert de la résistance à une souche sauvage Par étude de l’activité enzymatique de la polymérase en présence de l’antiviral

La présence de mélanges de souches peut être un obstacle à la détection des résistances Les souches testées sont le plus souvent les souches circulantes. Les souches mutées peuvent être sélectionnées au site de l’infection. Les souches mutées minoritaires peuvent ne pas être détectées, voire être perdues lors de l’isolement viral Chez un patient multitraité peuvent coexister des souches résistantes à différents antiviraux Intérêt des prélèvements au site de l’infection, en plus du prélèvement sanguin. Utiliser des méthodes sensibles Ce qui diminue beaucoup moins le fitness de la souche que l’accumulation de mutations

La détection précoce des souches résistantes est nécessaire Antiviral Isolat sauvage Souche mutée minoritaire Expansion de la souche résistante Souche sauvage (Cycle viral normal) Souche mutée During antiviral treatment its important to detect as early as possible resistant strains that can be minority within isolates Les techniques de séquençage doivent être standardisées et sensibles La sensibilité dépend de la méthode de séquençage

Patiente B. Lymphome Ducancelle et al., J.Clin Virol, 2005

Etude épidémiologique des isolats séquentiels Isolat B3 : GCV/CDV R, PFA S 3 souches

N495N/K L501I/L Consensus Sense Antisense AD169

495 501 Non détectée AD 169 GCC AAG ACT AAC TCG CCC AAC TAT AAG ATC ATG

Que représente la résistance aux antiviraux en pratique clinique après transplantation?

Les leçons du VIH : Incidence de la résistance Traitement cumulé Ganciclovir1 valganciclovir2 cidofovir3 Foscarnet3-4 3mois 7% 2% 29% 0-9% 6mois 12% 13-26% 9 mois 27% 9% 24-37% 12 mois 13% 37% 1 : Jabs et al, JID 1998; 2 : Boivin et al., JID 2001; 3: Jabs et al., AAC 1998; 4 : Weinberg et al., JID 2003

Recherche des souches résistantes circulantes Résistance du CMV aux antiviraux après transplantation d ’organe (Lurain, JID, 2002) 2 cohortes de patients : Cleveland : 2345 patients suivis de 1990 à 2001 (Etude prospective) Chicago : 200 patients présentant une infection active à CMV (Etude rétrospective) Tous sous GCV en prophylaxie ou traitement Recherche des souches résistantes circulantes Phénotype et génotype

Cohorte de Chicago (Lurain, JID, 2002)

Cohorte de Cleveland (Lurain, JID, 2002)

Facteurs de risque (Lurain, JID, 2002) Transplantation pulmonaire Statut D+/R- (28/30 patients hébergeant une souche résistante) Plusieurs mois ou années de traitement cumulé

Mutations : 19 patients -cohorte de Chicago (Lurain, JID, 2002) Résistance confirmée par le phénotype UL97 : 19/19 (100%) des patients ->codons 460 à 607 UL54 : 6/19 (30%) ->Résistance croisée au cidofovir (5/6) ->résistance associée au foscarnet (1/6, traité par foscarnet) Délai d ’apparition des mutations : UL97 : 5,5 à 36 mois UL54 : 5 à 13 mois, toujours après UL97

Les traitements prophylactiques sont-ils pourvoyeurs de résistance? En faveur : Inhibition incomplète de la réplication virale Val ACV =ACV < GCV GCV oral=> 45% versus 91% GCV IV Val GCV = GCV n ’empêchent pas la primo-infection (infection active pendant ou à l ’arrêt de la prophylaxie) administration prolongée En défaveur : Faible charge virale sous traitement Réversion de la population à l ’arrêt du traitement

Résistance du CMV après prophylaxie par ganciclovir oral (Limaye, Lancet, 2000) Toutes les souches résistantes portent des mutations dans UL97 en position 460, 594 ou 595

Résistance du CMVaprès prophylaxie par ganciclovir oral : facteurs de risque (Limaye, Lancet, 2000) Primo-infection (Charge virale élevée) : D+/R- (5/67, 7% versus 0/173) Immunodépression : Greffe de pancréas +/- rein (4/19, 21% versus rein 1/20, 5%)

Prophylaxie par GCV et résistances Traitement Organe Circonstances Mutants suivi N (%) GCV oral Tous Maladie à CMV UL97 1 an 5/240 (2,1) Limaye, 2000 Systématique 4m 2/103 (1,9) 1/33 (6,1) Boivin 2004 GCV oral# Poumon 6m 1/40 (2,5) Humar 2005 Val GCV / Val GCV# UL97/ UL54 6 m Val GCV* Rein >1 an Gruber, 2005 *Aucune maladie à CMV dans ce groupe, et donc aucune recherche de résistance # Taux élevé de virémies : 40 et 45 % pour valGCV et GCV respectivement

Résistance du CMV après traitement « préemptif » par ganciclovir IV en transplantation pulmonaire (Limaye, JID, 2002) 45 patients D+/R+ et D+/R- TT préemptif GCV IV 5mg/Kg/J x 2 n = 37 Prophylaxie GCV IV 5mg/Kg/j n = 8 Maladie à CMV due à une souche résistante au GCV 10% 3/18 1/2

Prophylaxie et résistances Valaciclovir Alain et al., 2004 : 27 receveurs de rein virémiques pendant ou à l’arrêt de la prophylaxie (suivi 1 an) Recherche systématique de résistance : 1/27 (3,8%) : UL97 M460I, sans conséquences cliniques, clearance spontanée du virus. Pavlopoulou et al., 2005 : 83 receveurs de rein Val ACV (43) versus GCV oral (40) Aucune suspicion de résistance pendant les 6 mois post-greffe

Evolution de la patiente BE. Fa Leucopénie Detection M460I VCV MMF AZA

Sélection précoce de résistance au GCV après valaciclovir chez un transplanté rénal (Hantz etal., AAC 2005)

Traitement préventif et résistances Deux tableaux se discernent : Résistances précoces : au cours ou à la fin de la prophylaxie Peu de conséquences cliniques Disparition spontanée de la virémie Associées à des charges virales faibles ou modérées (1000 à 10 000 copies) persistantes Résistances tardives survenant dans la première année Après plusieurs expositions aux antiviraux associées à une maladie à CMV de pronostic plus réservé Associant parfois plusieurs souches

Quelles alternatives peut-on envisager? Association de deux molécules (ganciclovir et foscarnet) Alternatives thérapeutiques : Baisse de l’immunosuppression (Anglicheau et al., 2003) Nouveaux antiviraux

Conclusion 1 L ’émergence de souches résistantes après transplantation d ’organe est possible, sous traitement prophylactique, anticipé, ou curatif. Elle est favorisée par : Des traitements sub-inhibiteurs prolongés avec persistance d ’une réplication virale Une profonde immunodépression Une charge virale élevée (antigénémie ou ADNémie) Un statut D+/R- Et doit donc être recherchée chaque fois qu ’une réplication virale persiste sous traitement bien conduit, malgré la levée de l ’immunosuppression C ’est pourquoi tout traitement anti-CMV, même prophylactique justifie une surveillance virologique

Conclusion 2 La mise en évidence d ’une souche résistante associe: Un test moléculaire sur sang total ou leucocytes (tube EDTA) Un isolement des souches virales circulantes (virémie, tube hépariné) chaque fois que possible Une étude des souches au site de l ’infection en cas de maladie à CMV

Observatoire de la résistance du CMV aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de moelle Centre National de Référence du Cytomégalovirus 1) Enquête rétrospective sur les prélèvements de l’année 2004, en cours 2) Enquête prospective avec recueil de données cliniques et virologiques et recueil systématique de prélèvement devant toute infection à CMV 3) Possibilité d’obtenir, sur envoi de souche ou de prélèvement, une recherche de résistance sous 8 jours.