La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour l’imagerie du vivant Exemples d’applications à l’étude du développement végétal François Roudier Equipe Différenciation et Identité Cellulaire Olivier Grandjean, principe confocal et autres outils d’imagerie Biologie Cellulaire

Aequorea victoria : ”l’inventeur” de la GFP Ne pas confondre reflection de la lumiere avec fluorescence

La GFP : une protéine fluorescente par transfert d’énergie

La GFP : une structure en lanterne et un fluorophore protéique auto-catalytique Auto-catalytique et stable - 238 aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles - Forte stabilité : résiste à 65C, à pH entre 5,5-12,2, 8M urée, 1% SDS, protéases (2j)

De la GFP sauvage à la GFP “améliorée” Plusieurs mutations ont été introduites pour : Optimiser l’expression de la protéine Usage optimal des codons et élimination d’un intron cryptique (20X plus de protéine) Maturation du fluorophore (4X plus vite) Modifier les propriétés spectrales de la protéine Pic d’excitation unique à 490 nm Brillance (X6) Un outil versatile pour l’étude du vivant…

La GFP : une protéine non toxique pour des méthodes de visualisation non invasives

Variants de la GFP et autres protéines fluorescentes CFP GFP YFP (DsRED) RFP Deux grands groupes de FPs : des dérives de la GFP, de la CFP a la YFP Un cluster de FPs fluorescant dans le rouge Discosoma striata

Des protéines fluorescentes avec différentes propriétés spectrales Differentes couleurs de fluo par differentes proprietes spectrales : differents pics d’excitation et d’emission Notions de chevauchement. Chez les plantes, on utilise bcp la GFP, puis YFP DsREd

Une plante modèle: Arabidopsis thaliana Visite serres juste après, poser les questions aux serristes

Organogenèse et Croissance indéterminée Le développement végétal est essentiellement post-embryonnaire et résulte de l’activité constante des méristèmes Animal Plante Zygote Embryon Replacer dans contexte developpemental : Anx: fecondation donne zygote puis embryon egal a adulte en miniature, adulte = croissance, maintien et Evolution constante… suivi au cours du developpement important Adulte Organogenèse et Croissance indéterminée

Les méristèmes contiennent les cellules souches et sont organisés en domaines fonctionnels Méristème apical Arabidopsis adulte Meristeme sont les structures qui permettent la formation des organes. Il sont organises en domaines avec des fonctions bien definies ise en place zones, evolution constante, necessite systeme de suivi in vivo…. Les FPs. A travers deux exemples, presenter quelques utilisations de FPs et le type de question biologique auxquelles elles peuvent permettre de repondre. Méristème racinaire

(fusion transcriptionnelle) - Profil d’expression d’un gène Exemples d’application de la technologie GFP à l’étude du développement des plantes pPromoteur:GFP (fusion transcriptionnelle) - Profil d’expression d’un gène - Etude fonctionnelle d’une protéine pPromoteur:CDS::GFP (fusion traductionnelle) Localisation subcellulaire Mouvement Reflet de l’activite du promoteur Interaction protéine-protéine (FRET) - Biosenseurs

Le méristème racinaire : une organisation dépendante de divisions stéréotypées des cellules souches Division asymétrique L’organisation et le fonctionnement du RAM dependent des divisions de cellules souches. De l’exterieur vers l’interieur : epid, cortex, endoderme, stele Une meme cellule souche est responsable de la generation du cortex et de l’endoderme suite a une division asymetrique

Deux mutants déficients dans la mise en place et la différenciation de l’endoderme L’un des atouts d’Arabidopsis est l’obtention de mutants et l’identification des genes affectes : approche de genetique directe, mutant, gene, proteine, fonction. Les mutants scarecrow et short-root sont deficients dans la mise en place de l’endoderme et correspondent a des TFs requis pour la division asymetrique. Dans un premier temps, on a voulu savoir ou SCR est exprime…

Expression de SCR dans la racine QC endodermis cortex c/e initiale Promoteur SCR GFP gene ARN GFP Generation fusion transcritionnelle entre le promoteur scr et le gene rapporteur GFP qui va permettre d’exprimer la GFP en fonction de l’activite spatiale et temporelle du promoteur. Lorsqu’on va au LSCM et qu’on realise des coupes optiques de la racine, on observe que la GFP est exprimee dans l’endoderme Protéine GFP GFP pSCR

Localisation de la protéine de fusion SCR::GFP QC endodermis cortex c/e initiale Promoteur SCR SCR gene GFP ARN Afin de determiner la localisation subcellulaire de SCR, Generation fusion traductionnelle entre le promoteur scr et la sequence codante du gene SCRrapporteur GFP qui va permettre d’exprimer la proteine de fusion SCR-GFP et d’observer sa localisation subcellulaire. SCR::GFP pSCR GFP SCR (Complémentation du mutant scr)

SCR est nécessaire pour la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine QC endodermis cortex c/e initiale cortex endodermis c/e initiale QC GFP pSCR pSCR GFP SCR

La protéine SHR bouge de la stèle vers l’endoderme ! SHR contrôle la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine de façon non cellule-autonome … st en co ep in qc st en co ep in qc Maintenant que vous etes des specialistes des fusions trans et trad, analysons le profil d’expression et la localisation de SHR SCR = cible + autre, digital in situ… GFP pSHR GFP SHR pSHR … La protéine SHR bouge de la stèle vers l’endoderme !

Analyse du transcriptome de l’endoderme racinaire Digestion paroi pSCR:GFP Plantules in vitro Récolte pointe racinaire (15000) Triage par fluorescence des protoplastes GFP+ Hybridation Extraction ARN Amplification Marquage des sondes Puce Affymetrix ATH1 25K gene arrays 300 000 protoplastes

Collection de marqueurs spécifique d’un type cellulaire Endo-dermis Lateral rootcap Epidermis Pericycle Collection de marqueurs spécifique d’un type cellulaire Si on realise ce protocole sur une collection de marqueurs des differents types cellulaires de la racine, on obtient Endo + Cortex QC

Le méristème apical caulinaire

Le méristème apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle pour la croissance, l’organogenèse et auto-maintien ZC ZM Auto maintien Tige Organes latéraux Feuille Jeune feuille Primordium P MAC un peu plus complexe car en plusdecroissance et maintien, gere aussi organogenese Mise en place des feuilles…

Le méristème apical caulinaire Une organogenèse dynamique et structurée Vue d’avion Cinétique sur 65h Acquisition toutes les 2h30

CUP-SHAPED COTYLEDONS Marqueurs moléculaires des zones fonctionnelles et identités cellulaires du MAC SHOOT MERISTEMLESS LEAFY AINTEGUMENTA CLAVATA3 ATML1 CLAVATA1 CUP-SHAPED COTYLEDONS WUSCHEL

pANT:GFP, un marqueur de l’initiation et de la mise en place des primordia foliaires Coloration vitale + pANT::GFP

Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération pANT:GFP T = 0h T = 24h Suivi d’un RAM au cours du temps: T0: 4 primordia T32, recrutement de cellules exprimant ANT donc ayant acquis l’identite de cellules appartenant a un primordium Croissance au cours du temps et en regardant de plus pres, T = 32h T = 48h

après le recrutement : prolifération cellulaire Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération après le recrutement : prolifération cellulaire On voit que au bout d’un certain temps, les primordia accroisse leur taille par division de cellules exprimant ANT:GFP plutot que par le recrutement de nouvelles cellules. 2 phases dans formation d’un primordium : initiation par recrutement et croissance par division

P0 P7 P6 P5 P4 P3 Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D Une disposition en spirale prédictible P0 P3 P5 P6 P2 P1 Cette disposition geometrique en spirale peut etre exprimee selon une suite mathematique simple, mais son contrôle genetique et physiologique reste inconnu. La theorie des champs inhibiteurs…. P7 P4

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs La theorie des champs inhibiteurs propose que chaque primordium nouvellement formes exerce (par un mecanisme inconnu) une action inhibitrice sur la formation d’un autre primordium 15

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs Zone centrale destinee a auto-maintien inhibe constamment

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs Primordium en developpement inhibe dans sa proximite

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs Apparition du mouveau primordium dans la zone non inhibee. Qu’est-ce qui inhibe le recrutement et la division des cellules…? Une phytohormone, l’auxine qui est transportee de facon polarisee L’auxine, une phytohormone transportée de façon polarisée, est impliquée dans le contrôle de la phyllotaxie

Transport polarisé de l’auxine (AIA): Localisation des transporteurs à l’aide de FPs 1 Transporteur d’influx (membrane apicale) 1 AIAH pAUX1:AUX1::YFP 2 AUX Sens du TPA AIA- H++ 3 2 1 Transporteur d’efflux (membrane basale) Le transport polarise de IAA est genere par la presence de transporteurs que l’on peut localiser a l’aide de FPs: On distingue deux types de transporteurs… PIN 2 pPIN1:PIN1::GFP AIAH 3 3

Un senseur transcriptionnel de l’auxine Modèle du contrôle de la phyllotaxie par PIN1 et des flux d’auxine (DR5:GFP) (pDR5 : 9 x AuxREs) pDR5:GFP Un senseur transcriptionnel de l’auxine P0 P1 P2 P3 Auxine Si on revient a la phyllotaxie, le modele actuel propose que par l’activite de transport de PIN1, l’auxine est pompee par les primordia des leur initiation, ce qui cree un gradient de concentration d’auxine. Et un maximun d’IAA a la position du futur primordium. On peut visualiser l’accumulation d’IAA grace a un biosenseur de cette phytohormone. Comme IAA est une molecule, pas possibilite de fusion GFP mais possibilite de créer un promoteur synthetique avec des elements de reponse a IAA qui vont permettre l’expression de la GFP dans les cellules ou il y a de l’auxine. A retenir surtout : Loc de transporteur d’efflux permet de faire une hypothese sur auxine et phyllotaxie 2) Generation du senseur d’auxine permet de verifier cette hypothese… Gradients locaux d’auxine par pompage

Interaction entre deux protéines

Mesure de l’interaction entre deux protéines par "Fluorescence Resonance Energy Transfert » (FRET) D A D A GFP RFP 1- Compatibilité spectrale des fluorochromes 2- Proximité moléculaire des fluorochromes Technique basee sur la propriete d’une proteine fluorescente de transferer son energie a une autre qui est alors capable de fluorescer. Co-localisation de deux protéines…

Application de la technology FRET au vivant : la protéine caméléon, un biosenseur du calcium Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans

Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans [Ca2+] nulle Excitation 440 nm CFP séparée de YFP (pas de FRET) [Ca2+] faible YFP/CFP faible (peu de FRET) [Ca2+] forte YFP/CFP élevé (FRET max)

Exemples d’application de la technologie GFP Quelques limites - Profil d’expression de gènes Localisation subcellulaire - Etude fonctionnelle de protéines Mouvement - Biosenseurs Interaction protéine-protéine (FRET) Limites : Sensibilité (difficile de détecter les gènes faiblement exprimés) Ajout d’une protéine (encombrement, environnement bio) Panoplie de FPs encore limitée Inconvenients de ses avantages Pas activite enzymatique, donc pas d’amplification du signal Ajout de GFP peu perturber fonctionnalite de proteine (comment tester? Complementation fonctionnelle) Materiel biologique vivant parfois incompatible : environnement membranaire, autofluorescence de composes (paroi, chlorophylle)… LHP1::GFP

Principe de transformation génétique stable chez les plantes Début de floraison Transformation de la lignée germinale Sélection des transformants à partir des graines

In situ “digitale” des différents types cellulaires de la racine Etapes de développement Assises cellulaires Carte en 2D de tous les genes exprimes dans l’ensemble es types cellulaires de la racine dans les conditions utilisees.