MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE L ’EXPRESSION DES GÉNES : LA TRANSCRIPTION DU DNA

Protéine fonctionnelle I- INTRODUCTION - DÉFINITION Rappel : définition moléculaire du gène Expression moléculaire du gène Clase II 5 ’ A B C 3 ’ Transcription mRNA rRNA tRNA Traduction Protéine fonctionnelle Définition de la transcription Segment de DNA (gène) Brin de RNA (séquence complémentaire du DNA : T U) Réplication (DNA copié entièrement)≠ Transcription (copie d ’un fragment) Régulation de la transcription : présence sur l ’ADN de séquences régulatrices (cible thérapeutique ++) Transcrit primaire RNA mature (cellules eucaryotes ) Modifications post-transcriptionnelles Concept d ’ARN messager (F. Jacob et J. Monod 1961) Hybride RNA-DNA refroidissement protéines 100° ADN G-C A-U + ARNm mRNA (P32) DNA db (T2) ARNm ribosomes Hybridation moléculaire

Chaîne matrice Chaîne matrice PPi base base - RNA polymérase base base II- Mécanisme général de la transcription 1- Réaction de biosynthèse de l ’ARN RNA (n) résidus + ribonucléotides triphosphate RNA (n+1) résidus + PPi RNA polymérase DNA dépendante Pyrophosphatase - matrice - précurseurs (ATP, GTP, CTP, UTP) - Mg 2+ 2 Pi 3 ’ Chaîne matrice R Chaîne matrice PPi base base 3 ’ - RNA polymérase O a ß g base 5 ’ base O 5 ’ RNA produit DNA matriciel Complémentarité des bases DNA matriciel RNA produit A 25 U 25 T 33 A 32 G 24 C 23 C 18 G 20 Ex : phage f X 174

Brin non matrice : brin codant = brin + RNA Brin matrice : brin - DNA Brin non matrice : brin codant = brin + RNA polymérase DNA dépendante Chez E.coli (390 000 Da) Association transitoire ß ’ w a Cœur de l ’enzyme ß s70 a Cellules eucaryotes RNA polymérase I (Pol I) : r RNA RNA polymérase II (Pol II) : m RNA RNA polymérase III (Pol III) : t RNA 2 - Déroulement de la transcription RNA polymérase initiation s70 +1 5 ’ 3 ’ DNA db 3 ’ 5 ’ -1 Synthèse du RNA promoteur

Promoteur de procaryotes - 35 -10 +1 5 ’ TTGACA TATAAT Départ du RNA 3 ’ Boite de Pribnow (séquences consensus) RNA polymérase Promoteur d ’eucaryotes +1 - 110 - 40 - 25 5 ’ GGCCAATCT CGGCGG TATAAAA Départ du RNA 3 ’ Boîte TATA Boîte CCAAT Boîte GC RNA polymérase + facteurs de transcription (TFII D)

Protéine se fixant sur l ’ADN Identification des promoteurs : techniques d ’empreintes ou “ foot printing ”  DNA marqué avec 32P Sans protéine Protéine se fixant sur l ’ADN Coupure par la DNAse Coupure par la DNAse “empreintes” Électrophorèse sur gel

s s RNA polymérase promoteur - 35 - 10 Complexe fermé Complexe ouvert 5 ’ 3 ’ 5 ’ 3 ’ Complexe fermé Complexe ouvert P-P-P-Pu RNA naissant NTP s PPi

3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 ’ Élongation RNA polymérase Brin codant Brin matrice Boucle de transcription 3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ DNA 3 ’ Hybride DNA-RNA 5 ’ RNA Direction de la transcription mRNA mRNA 3 ’ 5 ’ 3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ Gène A Gène B Gène C 3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ mRNA

UAAUCCCACA terminaison ARN : CG et UA Séquences riches en GC et AT sur le DNA matrice Dissociation de l’ARN pol Appariement des bases dans l ’ARN C UAAUCCCACA GACGCCG CUGCGGC U AUUUU(3 ’OH) C G 5 ’ Structure en “épingle à cheveux” Rupture de l ’hybride ADN-ARN Autre mécanisme : protéine r (activité RNA-DNA hélicase)

Modification des extrémités III- Modifications post-transcriptionnelles et régulation de la transcription 1- Maturation des ARN Modification des extrémités Extrémité 5 ’ : addition du chapeau “ Cap” 7 méthylguanosine H ARN nouvellement synthétisé 3 ’ Extrémité 3 ’ : queue poly (A) RNA + n ATP RNA-(AMP)n + nPPi Polyadénylate polymérase Signification biologique ? Cap : liaison du mRNA au ribosome Queue Poly A : protection du mRNA

Pré mRNA = transcrit primaire Excision et Epissage 5 ’ 3 ’ DNA exon 1 intron A exon 2 intron B exon 3 3 ’ 5 ’ transcription Pré mRNA = transcrit primaire exon 1 intron A exon 2 intron B exon 3 épissage exon A exon B exon C RNA mature Parfois épissage alternatif Ex : gène de l ’ovalbumine A B C D E F G 1 2 3 4 5 6 7 7700 pb transcription A B C D E F G 1 2 3 4 5 6 7 Épissage, polyadénylation 7 introns 1 2 3 4 5 6 7 AAAA(A)n chapeau 1872 nucléotides

2- Régulation de la transcription Substances régulatrices (répresseurs et inducteurs) ADN ARN m Protéine transcription Chez les procaryotes : l ’opéron (Ex opéron lactose) promoteur Gène régulateur Gènes de structure 5 ’ 3 ’ I P O A B C 3 ’ 5 ’ Opérateur (+ protéines régulatrices) Opéron en l ’absence de substrat à métaboliser (culture dans un milieu sans lactose) ARN polymérase 5 ’ 3 ’ I P O A B C 3 ’ 5 ’ 3 ’ 5 ’ Pas de transcription mRNA répresseur

répresseur-inducteur En présence du substrat ARN polymérase 5 ’ 3 ’ I P O A B C 3 ’ 5 ’ 3 ’ 5 ’ transcription mRNA enzymes + substrat (Inducteur) répresseur Complexe répresseur-inducteur

Bases de la thérapie cellulaire Chez les eucaryotes : -coeur - foie - squelette -cerveau -peau... - Cellules musculaires - hépatocytes - cellules osseuses - cellules nerveuses - cellules épithéliales ... 2n 2n différenciation Développement 2n 2n 2n zygote 2n 2n Cellules souches totipotentes Pluripotentes, multipotentes Développement embryonnaire Bases de la thérapie cellulaire Cellules souches = 2n 2n Cellules souches Cellules musculaire Fonction : spécialisation Fonction :ex contraction cardiaque Toutes les cellules d ’un organisme possèdent les mêmes gènes mais diffèrent par leurs protéines (fonctions différentes) Régulation de l ’expression des gènes Ex : régulation hormonale de la transcription

Complexe récepteur - hormone Hormone hydrophile Hormone hydrophobe Protéine porteuse récepteur Membrane Membrane Transduction du signal Molécule intracellulaire Relai Récepteur nucléaire Facteur de transcription Complexe récepteur - hormone + + protéines protéines Ex : glucagon Ex : glucocorticoïdes

Blocage de la transcription par les antibiotiques Actinomycine D Rifampicine Cas de l ’a amanitine (Amanite Phalloïde)