Transports ioniques dans les épithéliums respiratoires Dr Carole Planès MSBM 2005-06

PLAN Transports ioniques dans l’épithélium alvéolaire Rappels anatomiques Forces passives régissant les échanges d’eau au niveau alvéolaire Notion de transport actif d’ions par l’épithélium alvéolaire Mécanismes de la réabsorption d’ions Na+, d’ions Cl- et d’eau Importance physiologique de la clairance du fluide alvéolaire Transports ioniques dans l’épithélium des voies aériennes Régulation du volume de la phase SOL périciliaire Réabsorption active de Na+ - Sécrétion active de Cl- La protéine CFTR La mucoviscidose

Transports ioniques dans l’épithélium alvéolaire

T : bronchiole terminale; R : bronchiole respiratoire; V : vaisseau AD : canal alvéolaire; AS : sac alvéolaire; A : alvéole

Epithélium alvéolaire GR Alv. P1 O2 CO2 P1 : pneumocyte de type 1 1/3 des pneumocytes 95% de la surface P2 : pneumocyte de type 2 2/3 des pneumocytes 5% de la surface

Oedème pulmonaire

Hypophase alvéolaire (Epithelial lining fluid) Origine inconnue Composition : [Na+] ~ 135 mM [K+] ~ 7.3 mM pH ~ 6.9 Protéines : conc. proche du plasma Epaisseur ~ 200 nm Hypophase

= k [ (PHc – PHi) – ( c– i) ] Pulmonary capillary Interstitium PHc : pression hydraulique capillaire PHi : pression hydrostatique interstitielle pc : pression oncotique capillaire PHc > PHi pi : pression oncotique interstitielle = k [ (PHc – PHi) – ( c– i) ] H20 Q . pc >pi Endothelium lymph

pi pc >pi p A ? Pulmonary capillary Interstitium Alveolus Surface tension PHc > PHi pi ? p A ? pc >pi PHi PHA > PHi ? Hypophase Endothelium lymph Epithelium

Méthode de mesure de la réabsorption du fluide alvéolaire (« Clairance alvéolaire »)

Alveolar liquid clearance in the sheep 50 40 serum Excess Lung Water (ml) 30 Ringer lactate 20 2 4 hours Matthay et al, J. Appl. Physiol. 1982

Alveolar Fluid Clearance in Sheep 20 30 40 50 60 70 6 8 10 12 Alveolar protein concentration (g/100 ml) Protein Oncotic Pressure (mmHg)

LA REABSORPTION DE LIQUIDE INTRA ALVEOLAIRE PHENOMENE ACTIF ? Réabsorption du liquide intra alvéolaire malgré p alvéolaire élevée Réabsorption du liquide alvéolaire dépendant de la température Réabsorption du liquide alvéolaire persistant dans un poumon non ventilé Inhibition de la réabsorption par un inhibiteur du transport du Na+ (amiloride) administré dans l’instillat, ou par un inhibiteur de la Na,K-ATPase (ouabaïne) dans le perfusat.

TRANSPORTS DES IONS ET D’EAU DANS LES EPITHELIUMS Apical Cl- ddp ? Na+ H2O Cl- Basolatéral

TRANSPORTS DES IONS ET D’EAU DANS LES EPITHELIUMS Apical Cl- Na+ ddp ? H2O Na+ Basolatéral

TRANSPORTS DES IONS ET D’EAU DANS LES EPITHELIUMS Apical Cl- Na+ Cl- ddp ? Na+ H2O Na+ Cl- Basolatéral

TRANSPORTS TRANSMEMBRANAIRES

Dépendance de la réabsorption vis-à-vis des ions Na+ et Cl- Instillat Poumon de rat Isolé-perfusé 150 (Basset et al. J. Physiol., 1987) 100 Fluid absorption rate (nl/s) 50 * Contrôle * Na+ = 145 Na+ = 0 Cl- = 129 Cl- = 0

Réabsorption transépithéliale active d’ions + passage passif d’eau par osmose Pneumocyte I Hypophase alvéolaire Lumière alvéolaire Pneumocyte II H2O Na+ Cl- Capillaire pulmonaire

Voies de transport du Na+ dans l ’epithélium alvéolaire Perfusate Instillate 150 * * 100 Fluid absorption rate (nl/s) 50 * C No Glucose Amiloride 10-4 M Amiloride No glucose ouabain Basset et al. J. Physiol. 384:325, 1987

Salt transport across alveolar epithelium in vivo amiloride alveolus hypophase Na Glu Na K b1 b1 a1 a1 K Cl interstitium ouabain Na

CULTURE CELLULAIRE DE P2 ETUDE IN VITRO CULTURE CELLULAIRE DE P2 Elastase 21% O2, 5% CO2, 74% N2 PO2 milieu = 150 mmHg Culture cellulaire pendant 4 j Isolement de pneumocytes II de rat

ENaC CANAL SODIQUE EPITHELIAL SENSIBLE A L’AMILORIDE a g b a 3 sous-unités homologues assemblées en hétérotétramère ? Exprimées par les pneumocytes 1 et 2

Na,K-ATPase et clairance alvéolaire Sous-unité catalytique Site de fixation de l’ouabaïne Isoforme a1 : P1 et P2 Isoforme a2 : P1 seulement Sous-unité glycosylée Régule l’assemblage de l’hétérodimère a/b Permet l’insertion dans le membrane b1 isoforme dans P1 et P2

Transport des ions Cl- : Paracellulaire ou transcellulaire ? alvéole CFTR ? hypophase ENaC Na Glu Cl Na Na K b1 b1 KCC a a Cl K K Cl interstitium Na

TRANSPORT de l’EAU : rôle des AQUAPORINES ? H20 ? ENaC Na Glu Cl Na Na K b1 b1 a KCC a K Cl K Na

ALVEOLAR FLUID CLEARANCE IN AQP 1 AND AQP 5 NULL MICE

Régulation du transport de Na+ Et de la clairance du fluide alvéolaire Stimulation Catécholamines et agonistes b-adrénergiques Corticostéroïdes KGF TGF-a, EGF TNF-a Dopamine Diminution Dérivés réactifs de l’O2 et du NO Anesthésiques halogénés Hypoxie ANF, TGFb

Régulation dépendante des catécholamines Catécholamines endogènes : Epinéphrine (b2R) Norépinéphrine (a1R et bR) Agonistes b2-adrénergiques : Terbutaline Salmétérol Dobutamine Agoniste b1- et b2-adrénergique Isoprotérénol

EFFECT OF BETA ADRENERGIC AGONISTS ON ALVEOLAR EPITHELIAL LIQUID CLEARANCE 1. Sheep ( by 50-60 %) 2. Dogs ( by 75-150 %) 3. Rabbits (no effect) Rats ( by 45-135 %) Mice ( by 60-70 %) 6. Humans (↑ by 70-100%)

Les b2 agonistes ont une action couplée sur les canaux sodiques et la Na,K-ATPase Stimulation de l’adénylate cyclase ↑ AMPc Activation protéine kinase A (PKA) Insertion des sous unités a, b, g ENaC dans la membrane apicale à partir du pool sous membranaire Augmentation de la probabilité d’ouverture et du temps d’ouverture des canaux cationiques non sélectifs Insertion des sous unités a1 et b1 Na,K-ATPase dans la membrane basolatérale à partir du pool sous membranaire

Importance du transport ionique transépithélial alvéolaire ? A la naissance En cas d’œdème alvéolaire Si et seulement si l’épithélium alvéolaire est intact !

Souris déficiente pour aENaC

Œdème pulmonaire

Transports ioniques dans l’épithélium des voies aériennes

Epithélium pseudostratifié, comprenant des cellules sécrétoires et des cellules ciliées, responsable de la clairance mucociliaire

Mucus de trachée de lapin : phase SOL / phase GEL Cils Phase SOL (périciliaire) : très fluide, hydroélectrolytique (Na+, Cl-), 6-7 µm de hauteur (= hauteur des cils en extension) Phase GEL : visqueuse, contenant des agrégats de glycoprotéines de haut poids moléculaire (= mucines), hauteur variable

Effet de l’hydratation sur le mucus de trachée de lapin : la phase SOL du mucus reste d’épaisseur constante (~7 µm, soit la hauteur des cils en extension) Phase GEL hydratée GEL Cils SOL Phase GEL déshydratée

Variations de la surface de section des voies aériennes humaines Trachée : 2.5 cm2 Mucus Réabsorption de fluide Sacs alvéolaires : 1 m2

Réabsorption active de Na+ Phase SOL Na+ Cl- H2O ENaC b1 a Interstitium Na,K-ATPase

Possibilité d’une sécrétion active de Cl- Phase SOL Cl- Cl- Na+ Na+ Cl- H2O H2O ENaC CFTR b1 a Na+ K+ 2Cl- Interstitium Na,K-ATPase

Selon les circonstances, l’épithélium des voies aériennes absorbe activement du Na+ ou sécrète activement du Cl- pour maintenir constant le volume de la phase SOL. ASL : airway surface Liquid PCL : periciliary liquid Culture primaire de cellules des voies aériennes

La protéine CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Famille des protéines ABC (ATP Binding Cassette) MW forme mature ~ 170 kDa MSD : Membrane Spanning Domain NBD : Nucleotide Binding R : Regulation Domain

La protéine CFTR Protéine multifonctionnelle : Conductance Cl- Protéine régulatrice : inhibition d’ENaC Rôle dans l’exocytose des protéines, dans l’apoptose Expression de la protéine dans les voies aériennes : Cellules ciliées : + Cellules de Clara : ++ Epithélium glandulaire : +++ Le canal CFTR et la sécrétion active de Cl- est stimulée par : Les agents qui augmentent l’AMPc (PKA) : b-agonistes, forskoline Les agents qui augmentent le Ca2+ intracellulaire, Les agents qui activent la PKC Les nucléotides triphosphate : ATP, UTP …

La mucoviscidose : mutation du gène CF (« Cystic Fibrosis » sur chr. 7) Maladie autosomique récessive (1/3000 à 1/5000 naissances) touchant les épithéliums exprimant CFTR : voies aériennes, voies biliaires, pancréas, intestin, glandes sudoripares. 90% des décès sont dûs à l’atteinte respiratoire : Mucus très visqueux → altération de la clairance mucociliaire et obstruction bronchique → infections respiratoires récidivantes (haemophilus influenzae, staph. Aureus, Pseudo. Aeruginosa) → destruction des tissus bronchiques (bronchectasies) et pulmonaires vers une insuffisance respiratoire obstructive. > 1000 mutations répertoriées dont 5% sont représentées à plus de 2%

La mutation la plus fréquente: delta F 508 DF508 : 70% des allèles CF Délétion d’une phénylalanine en position 508 Anomalie de maturation de la protéine CFTR qui n’est pas adressée à la membrane apicale

La mutation la plus fréquente: delta F 508

Mucoviscidose : hypothèse « isotonique » de réduction de volume Phase SOL Cl- Na+ Na+ Cl- H2O H2O ENaC CFTR _ b1 a Na+ K+ 2Cl- Interstitium Na,K-ATPase

Mucoviscidose : hypothèse « isotonique » de réduction de volume Phase SOL Cl- Na+ Na+ Cl- H2O H2O ENaC CFTR _ b1 a Na+ K+ 2Cl- Interstitium Na,K-ATPase