TD n°2 Chromatographie

PRINCIPE : La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les constituants d'un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).

LES DIFFERENTS TYPES DE TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES : Classification des chromatographies en fonction des mécanismes de séparation : Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge électrique, la présence de groupements d'atomes formant des sites particuliers. Les différents types de chromatographie résultent du fait que l'on a privilégié l'effet de l'un de ces facteurs, mais l'exclusivité d'un mécanisme n'est jamais totale au cours d'une séparation chromatographique.

1/ CHROMATOGRAPHIES EN PHASE LIQUIDE (CPL) : La phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on distingue : 1-1/ Les chromatographies de PARTAGE : La chromatographie de partage : C'est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte. Cette chromatographie est ainsi dénommée car elle est basée sur le partage du soluté dans les deux phases liquides (chromatographie sur papier).

1-2/ Les chromatographies d'ADSORPTION : La chromatographie d'exclusion : Elle est encore appelée chromatographie d'exclusion-diffusion, tamisage moléculaire, gel de filtration, perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel. 1-2/ Les chromatographies d'ADSORPTION : La chromatographie d'adsorption : C'est une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire.

La chromatographie sur échangeurs d'ions : La phase stationnaire est un échangeur d'ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés négativement ou positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques du milieu. La chromatographie d'affinité : La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique (bio-affinité) pour un soluté de l'échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps).

2-2/ Les chromatographies en phase GAZEUSE (CPG) : La phase mobile est un gaz vecteur. On distingue dans ce cas: La chromatographie gaz-liquide : C'est une chromatographie de partage. La phase stationnaire est un liquide fixé par imbibition d'un support inerte. La chromatographie gaz-solide : C'est une chromatographie d'adsorption. La phase stationnaire est un solide adsorbant.

1/ Chromatographie sur papier : Extraction et séparation des pigments: Les chlorophylles et les caroténoïdes sont solubles dans des solvants organiques et peuvent donc être séparés à l'aide de solvants ou de mélanges de solvants des lipides. Ces molécules sont dites liposolubles.

Extraction des pigments bruts : La feuille est broyée dans de l'alcool absolu ou de l'acétone. Les pigments solubles dans les solvants organiques sont extraits. Après filtration pour éliminer les débris cellulaires, on obtient une solution brute de pigments.Il est alors possible de séparer les différents pigments de la solution brute. Une méthode simple, essentiellement qualitative, peut être réalisée par une chromatographie sur papier.

on dépose une goutte de pigments bruts sur une feuille de papier on dépose une goutte de pigments bruts sur une feuille de papier. On place la feuille de papier dans un récipient hermétique dans lequel on a placé un solvant approprié. Le solvant monte dans la feuille par capillarité en entraînant les pigments de manière différentielle selon leur affinité avec le solvant. On peut distinguer ainsi deux catégories principales de pigments : les chlorophylles (vertes) et les caroténoïdes (jaunes).

2/ Chromatographie sur couche mince: Ce type de chromatographie est utilisée pour séparer des composants dans un but d'analyse (CCM analytique) ou de purification (CCM préparative). On trace un trait horizontal (la ligne de base) à environ 1 cm du bas de la plaque de CCM. Les marques D, B et M représentent respectivement le produit de Départ, le Brut réactionnel et le point Mixte (un mélange de D et B). Le point mixte permet de mieux visualiser les taches lorsqu'elles sont très proches ou lorsque l'étape d'élution est imparfaite.

On dépose, à l'aide d'un capillaire ou d'une micro-seringue, une petite quantité d'une solution du produit de départ sur les marques D et M et une petite quantité du brut réactionnel sur les marques B et M. Dans cet exemple, le produit de départ est incolore (cercle en pointillé) alors que le brut réactionnel est légèrement coloré. On place la plaque de CCM dans une cuve contenant l'éluant (environ 5 mm). Le solvant monte le long de la plaque par capillarité. Lorsqu'il arrive presque en haut de la plaque, on sort celle-ci de la cuve et on laisse l'éluant s'évaporer. Ici, on ne voit que les taches 3 et 5 puisque les autres sont incolores. On observe que la tache 5 n'a que très légèrement migré au-dessus de la ligne de base.

Pour visualiser les différentes taches, on commence par placer la plaque sous une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en vert fluorescent et les produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme de taches sombres. On utilise cette méthode de détection en priorité car elle n'endommage pas la plaque. Dans cet exemple, on voit que le brut réactionnel contient encore du produit de départ (tache 4) mais la taille de la tache indique qu'il y en a moins qu'en début de réaction. On observe la formation d'au moins trois nouveaux produits (1, 2 et 5) : 1 et 2 sont moins polaires que le produit de départ, et 5 est plus polaire. Il semble que le produit 5 est majoritaire dans le brut réactionnel (le produit 2 est beaucoup moins visible) mais tous les produits ne révèlent pas avec la même intensité aux UV.

On plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il existe de nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque jusqu'à ce que des taches colorées apparaissent. Ici on observe un autre produit (3) qui n'était pas visible aux UV. La tache 1 est à peine visible ; elle l'était beaucoup plus sous lampe UV. La surprise vient de la tache 2 : elle n'était que faiblement visible en UV mais elle révèle très intensément avec la vanilline. Il est fort possible que ce soit le produit majoritaire de la réaction et non le produit 5 comme le laissait comme le laissait supposer la détection UV.

3/ Chromatographie de gel de filtration ou tamis moléculaire ou d’exclusion stérique: Ce type de chromatographie permet de séparer les protéines et de déterminer leurs masses molaires. Pour cela, il faut calibrer le gel et obtenir une droite de calibration. Un mélange de protéines standards de masses molaires connues sont séparées dans les mêmes conditions que les protéines de l’échantillon (Figure).

Exemple: thyroglobuline (669 kDa), ferritine (440 kDa), catalase (232 kDa), lactate déshydrogénase (140 kDa) et albumine (66 kDa). Le profil d’élution est tracé après mesure d’absorbance à 280 nm des fractions éluées. le volume d’élution Ve de chaque protéine de référence est déterminé. le bleu Dextran (2.106 Da) permet de déterminer le volume mort Vo du gel. La droite de calibration est : Ve/Vo = f (log PM) (figure ci-dessous). Les protéines de l’échantillon sont ensuite séparées dans les mêmes conditions et l’absorbance à 280 nm des fractions éluées est mesurée. Par comparaison avec la droite étalon, on peut ainsi déterminer la masse molaire des protéines.