Introduction à la virologie MICROBIOLOGIE DCEM-1 ANNEE UNIVERSITAIRE 2008-2009 Nicolas LEVEQUE CHU Robert Debré-Laboratoire de virologie Mail : nleveque@chu-reims.fr

Introduction à la virologie Qu’est-ce qu’un virus ? La réplication virale Modes de transmission des infections virales

Qu’est-ce qu’un virus ?

« Les virus sont les virus » A. Lwoff 1957

20 à 200 nm

Les virus Entités nucléo-protéiques (ARN ou ADN) Comprennent toujours au moins deux éléments: le génome et la capside (boite) L’enveloppe dérive de la membrane cellulaire Ne se multiplient pas de manière autonome (réplication)  parasites intra-cellulaires obligatoires Absence de croissance

Structure Schématique Génome (ADN ou ARN) Capside protéique (capsa) + Nucléocapside (core) = Virus nus = Virus enveloppés Enveloppe (péplos) (bicouche lipidique) + Nucléocapside (core)

Le génome viral Un virus = information génétique limitée ARN = fragile d’où une taille limitée - 7 kb pour les Picornaviridae et les Astroviridae à 30 kb pour les Coronaviridae - cas du virus de l’hépatite delta (1.7 kb) ADN = plus complexes - de 3 à 300 kpb - capacités de codage très différentes: de 4 gènes pour le VHB à plus de 80 pour HSV

La capside Structure protéique d’origine virale (une ou plusieurs protéines polymérisées) Protège le génome  nucléocapside 3 organisations symétriques hélicoïdale cubique ou icosaédrique complexe

De symétrie hélicoïdale Virus de la mosaïque du tabac Paramyxovirus

De symétrie cubique

De symétries complexes Symétrie cubique Symétrie hélicoïdale Certains bactériophages

L’enveloppe virale ou peplos = Bicouche lipidique provenant du système membranaire cellulaire + Protéines /glycoprotéines virales  Elément de fragilité (température, dessiccation, sucs digestifs…) Enveloppe  cuirasse = tendon d’Achille

L’enveloppe virale ou peplos Impact sur l’épidémiologie Grippe : Transmission directe et rapprochée Favorisée par l’air humide et froid hiver Poliovirus : transmission fécale-orale (mains sales, eau ou aliments souillés)

Classification des virus Repose sur la structure des virus et non sur le pouvoir pathogène Nature de l’acide nucléique (ARN ou ADN) Conformation de la capside (tubulaire ou cubique) Présence ou absence d’une enveloppe

Multiplication des virus dans la cellule Virus = parasite intracellulaire obligatoire Rencontre virus/cellule  production de nouveaux virus = réplication Phénomène complexe  machinerie cellulaire détournée Certaines étapes spécifiques du virus  cible pour molécule antivirale

Multiplication des virus dans la cellule Information génétique : ARN ou ADN Matière première : Acides aminés, acides gras, sels minéraux Source d’énergie : ATP Accélérateurs biologiques = enzymes

Les différentes étapes du cycle de réplication

Multiplication des virus : L’adsorption Contact virus/cellule  Protéines de la capside  glycoprotéines de l’enveloppe Récepteur cellulaire  tropisme d’hôte (grippe aviaire)  tropisme tissulaire (CD4 et VIH)

Milieu extracellulaire La pénétration : Les barrières cellulaires rencontrées au cours de l’infection Milieu extracellulaire Glycocalyx Membrane cellulaire Réseau d’actine Cytoplasme

Retarder la détection par le système immunitaire Conditions optimales →pH, protéases, thioloxydases →Adressage cellulaire Préserver l’intégrité de la membrane cellulaire

Pénétration et décapsidation Virus enveloppés Fusion

Pénétration et décapsidation Virus non enveloppés Lyse/perforation o

Expression et réplication du génome viral Réplication : duplication du matériel génétique Informations contenues dans génome viral traduites en protéines non structurales (enzymes, …) protéines structurales (construction de nouvelles particules virales)

Réplication des virus à ADN

Réplication des virus à ARN Virus à ARN positif : ARN (+) ARN génomique directement messager  synthèse protéique ex : virus de la poliomyélite

ARN génomique pas directement messager Virus à ARN négatif : ARN (-) ARN génomique pas directement messager transcription de l’ARN(-) en ARN (+) nécessaire ARN polymérase ARN dépendante (transcriptase) ARN (+) synthétisé sert d’ARNm

Rétrovirus RT RT intégrase ARN ADN simple brin ADN double brin ADN proviral intégré

Multiplication des virus La réplication ARN Hémagglutinine Neuraminidase Anticorps Acide sialique Glissement antigénique

Multiplication des virus L’assemblage  Encapsidation du génome viral La libération hors de la cellule Par éclatement cellulaire pour les virus nus Par bourgeonnement pour les virus enveloppés

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales Transmission salivaire Transmission par contact cutané

Lutte contre les infections virales Mesures d’hygiène : Last but not least

Diagnostic des infections virales

Pourquoi faire du diagnostic en virologie ?

Pourquoi faire du diagnostic en virologie ? Dons de sang, d’organes et de tissus (dépistage obligatoire) Suivi biologique des infections (VIH, VHB, VHC) Mesures prophylactiques et contrôle des épidémies rota et VRS en pédiatrie - grippe Etudes épidémiologiques (prévalence, réservoir, mode de transmission) Preuve de l’origine virale d’une infection +++ chez immunodéprimés Décision thérapeutique développement des antiviraux

Plusieurs approches = approches complémentaires Recherche des anticorps = Sérologie = Diagnostic indirect Recherche du virus ou de ses constituants = Diagnostic direct = approches complémentaires (fonction du virus recherché et de la clinique) L’analyse comprends plusieurs phases : Prélèvement = phase pré-analytique Choix de techniques et réalisation = phase analytique Validation et interprétation

Phase pré-analytique : le prélèvement 1. Choix des prélèvements à effectuer Selon la clinique (toute lésion accessible doit être prélevée) Porte d’entrée, sites de multiplication et/ou d’excrétion des virus recherchés 2. Réalisation des prélèvements Importance +++ de la qualité du prélèvement Doit être réalisé le plus tôt possible après le début des signes cliniques (multiplication +++ pendant phase d’incubation) 3. Acheminement des prélèvements au laboratoire Milieux de transport pour virologie (+++ pour culture de virus) Transport rapide Sécurité Importance des renseignements cliniques transmis au virologue avec le prélèvement

Diagnostic indirect = sérologie Recherche des anticorps ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) : substrat développé pour tous types de virus, automatisable, adapté à de grandes séries différencie IgG et IgM

Diagnostic virologique La séroneutralisation

Sérologie +++ Pour diagnostic des primo-infections = apparition des Ac entre deux sérums d’un patient 2 sérums : sérum précoce (neg) – sérum tardif (pos) Pour définir le statut immunitaire vis-à-vis d’un virus = savoir si un patient a déjà rencontré un virus précis (Ac pos) ou non (Ac neg) 1 sérum

Diagnostic direct Recherche du virus ou de ses constituants : Détection d’antigènes – techniques immunologiques Détection de génome (ADN ou ARN) – biologie moléculaire Détection du virus entier – culture virale Observation des particules virales (microscopie électronique) Si résultat positif avec clinique concordante = preuve de l’implication d’un virus dans une infection

Détection des antigènes du virus : IF, ELISA Techniques simples et rapides à mettre en œuvre mais manque de sensibilité Mise au point des anticorps monoclonaux en 1975-1980 Détection : Ag dans des cellules (immunofluorescence) Ag libre ou libéré (ELISA ; agglutination ; immunochromatographie) - contrôle de la spécificité de la réaction +++ selles (rotavirus, adénovirus) pvts respiratoires (VRS, grippe, rougeole) lésions cutanéomuqueuses (HSV, VZV)

Diagnostic direct : détection du génome PCR = polymerase chain reaction 30 x 1989 DNA polymerase Très nombreuses copies de l’ADN …

Diagnostic virologique La RT-PCR entérovirus Méthodes actuelles  automatisation  extraction automatique de l’ARN (Easymag….)  automates de PCR (TaqMan, Light Cycler, Smart Cycler)

Diagnostic virologique La RT-PCR entérovirus Sample in, answer out … « La Révolution GeneXpert »…

Diagnostic direct : détection du génome Principales applications HSV dans LCR pour méningo-encéphalite (urgence) CMV : PCR quantitative (greffés de rein) VIH : PCR qualitative (dépistage chez nouveau-né) et PCR quantitative (charge virale pour suivi thérapeutique) VHC : sérologie + PCR

Diagnostic direct : culture de virus Equipement +++ hotte à flux laminaire car manipulations en environnement stérile Microscope Incubateur à CO2 …

Diagnostic direct : culture de virus Technique de référence Virus = parasites intracellulaires obligatoires Ne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes animal (Coxsackievirus A types1 à 6) œuf de poule embryonné (virus de la grippe, poxvirus) cellules en culture in vitro Importance d’un transport rapide jusqu’au laboratoire pour conserver le pouvoir infectieux du virus Dans milieu de transport = MEM + protéines (SVF) + tampon + ATB

Diagnostic direct : culture de virus

Microscope électronique

Virus du SARS Virus herpes simplex (HSV)