Mesure de l’activité ATPase d’une enzyme par fluoresence Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Connaître la quantité de protéine renaturée Introduction Thèse de Thomas Ballet Connaître la quantité de protéine renaturée Démarche: Procéder par étape Courbe standard de chaque réaction Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Réactions Enzyme + substrat + enzyme + produit Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Principe de la fluorescence Valeur de λ Résorufine λmax absorption = 530 nm λmax émission = 585 nm Choix des filtres λabsorption = 540 nm λ émission = 600 nm Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

La solution tampon : élément clé TRIS : 50 mM MgCl2 : 20 mM KCl : 150 mM A pH = 7.2 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Première étape : gamme étalon de H2O2 AmplexRed + H2O2 Resorufine HRP AmplexRed + H2O2 Resorufine Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Première étape : gamme de H2O2 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Première étape : gamme de H2O2 Puits 1 2 3 4 H202 (2 µM) 10 30 50 100 AR (50 µM) HRP (0,3 U/ml) 20 Tris 160 140 120 70 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Première étape : gamme étalon de H2O2 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Influence du DTT Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Deuxième étape : gamme d’ADP globale Enzyme + substrat + enzyme + produit Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Deuxième étape : essai de la réaction globale Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Troisième étape : gamme de pyruvate oxydase Enzyme + substrat + enzyme + produit Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Troisième étape : gamme de pyruvate oxydase A B 1 2 3 4 5 Pox (µL) [à 15 U/mL] 10 15 20 30 Pyruvate (µL) [à 50 µM] FAD (µL) [à 25 µM] TPP (µL) [à 250 µM] Phosphate (µL) [à 10 mM] HRP (µL) [à 0.1 U/mL] AR (µL) [à 50 µM] Tris (µL) 96 88 83 78 68 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Troisième étape : gamme de pyruvate oxydase Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Quatrième étape : gamme d’ADP globale Enzyme + substrat + enzyme + produit Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Quatrième étape : gamme d’ADP F G 1 2 3 4 5 6 Blanc ADP (µL) 10 [à 10 µM] 50 [à 10 µM] 80 [à 10 µM] 10 [à 100 µM] 50 [à 100 µM] 80 [à 100 µM] FAD (µL) [à 250 µM] TPP (µL) [à 2.5 µM] PPP (µL) [à 250 µM] HRP (µL) [à 0.1 U/mL] 20 kinase (µL) [à 50 U/mL] 45 oxidase (µL)[à 15 U/mL] 30 AR (µL) [à 50 µM] 10 Phosphate (µL) [à 10 mM] Tris (µL) 75 35 85 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Quatrième étape : gamme d’ADP Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Dernière étape : gamme de pyruvate kinase Enzyme + substrat + enzyme + produit Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Dernière étape : gamme de pyruvate kinase A B 1 2 Blanc P Kinase (µL) [à 238 U/mL] 9 90 ADP (µL) [à 100 µM] 10 PPP (µL) [à 250 µM] 20 Pox (µL) [à 15 U/mL] 30 Pyruvate (µL) [à 50 µM] FAD (µL) [à 250 µM] 3 TPP (µL) [à 2.50 mM] Phosphate (µL) [à 10 mM] HRP (µL) [à 0.1 U/mL] AR (µL) [à 50 µM] Tris (µL) 83 92 Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Dernière étape : gamme de pyruvate kinase Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017

Résultats prometteurs Utilisation du procédé: Conclusion Résultats prometteurs Utilisation du procédé: Cinétique possible Mesure finale (?) Solutions envisagées Kinase plus concentrée Merci de votre attention Projet ATPase Danini Paul - Fouan Damien - Perret Thomas - Renaudot Raphael 26/03/2017