A caspase-dependent cleavage of CDC25A generates an active fragment activating cyclin-dependent kinase2 during apoptosis A Mazars, A Fernandez-Vidal, O Mondesert, C Lorenzo, G Prévost, B Ducommun, B Payrastre, C Racaud-Sultan and S Manenti Un clivage caspase-dépendant de CDC25A gènère un fragmnt actif qui active la kinase CDK2 pendant l’apoptose Cell Death and Differentiation (2008)

Famille Cdc25 Contient 3phosphatases CDC25A CDC25B CDC25C Contrôlent la progression des cellules eucaryotes dans le cycle cellulaire Activation séquentielle des complexes CDK/cycline Kinases dépendantes des cyclines=CDK Sont impliquées dans l’activation séquentielle des CDK associées à leur cycline Intervient à la fin de la cascade d’activation….L'activité des complexes CDK/cycline est notamment régulée par une balance entre phosphorylation inhibitrice (Wee, Myt) et déphosphorylation activatrice par les phosphatases CDC25 Wee Myt CAK Phosphorylations Inhibitrice Déphosphorylation activatrice

Double spécificité CDC25A Impliquée dans l’entrée en Mitose par son action dans la déphosphorylation activatrice du MPF, mais elle n’est pas seule impliqué dans cette activation. Mais elle a surtout une Fonction essentielle comme régulateur de la phase G1… ou elle va activer la kinase CDK2 du complexe CDK2/cyclineE et ainsi permettre le passage en phaseS De part son implication dans la progression du cylcle cellulaire, il est donc necessaire que CDC25 soit finement régulée…et sa dérégulation a dailleurs été constatée dans certains cancers. En ce qui concerne sa régulation, certains signaux extracellulaires comme des facteurs de croissances ou l’intrleukine7 vont être capable de l’activer, mais il existe aussi des signaux en provenance du milieu extracellulaire, qui vont être capable d’induire sa dégradation Double action dans le passage des Checkpoints du cycle cellulaire Transition G1S Transition G2M

Dégradation de CDC25A Dépendante du protéasome (Sa dégradation est donc necessaire à la régulation du cycle cellulaire…et) le principal système de dégradation que nous lui connaissons est celui-ci.. Dans le cas d’un stress génotoxique, donc capable de générer un dommage à l’ADN, les kinases Chk1 et ChK2 vont la phosphoryler. Elle sera ainsi reconnue par les ligases qui vont l’adresser au protéasome pour qu’elle soit dégradée. Le fait que le complexe CDK2/cyclineE ne soit pas activé va provoquer l’arret en G1 Les rôles de CDC25A dans le cycle cellulaires étant bien connus, certains chercheurs se sont demandés si cette phosphatase pouvait avoir un rôle dans l’apoptose

CDC25A et Apoptose Rôle anti-apoptotique VS Rôle apoptotique Role anti-apoptotique en réponse à un retrait de sérum Rôle pro-apoptotique dans l’apoptose induite par C-myc Rôle anti-apoptotique dans l’apoptose induite par ASK1 En ce qui concerne son rôle dans l’apoptose, différentes études s’opposent. Certaines confèrent à CDC25 un rôle anti apoptotique, notamment en réponse à nun retrait de sérum ou dans l’apoptose induite par ASK1. Une autre étude lui confère un rôle proapoptotique dans la mort induite par C-myc..et affirme même qu’elle serait la cible transcriptionnelle directe de c-myc. Au vues de ces avis partagés, les checheurs se sont dont interessés de plus près au rôle de CDC25A dans l’apoptose et se sont posés la question suivante Les rôles CDC25A dans l’apoptose sont encore peu connus

Quel est le rôle de CDC25A dans l’apoptose des cellules leucémiques? (Pourquoi les cellules leucémiques?Car ce sont des cellules qui sont hautement sensibles aux inhibiteurs du protéasome, les inhibiteurs des protéasomes étant des inducteurs efficaces de l’apoptose.)

Comment réagit CDC25A à l’apoptose induite? Induction de l’apoptose par inhibition du protéasome 33kDa La première question qu’ils se sont posée est: comment réagit CDC25A à l’apoptose induite. Ils ont donc induit l’apoptose en incubant les cellules pendant 0, 5 ou 15h avec un inhibiteur du protéasome, ici MG. Ils ont ensuite réalisé une immunoprécipitation de CDC25A suivie d’un immunoblot avec des Ac dirigé contre la partie C-ter de CDC25A. PARP a été utilisé comme un marqueur de l’apoptose, ici. Donc on peut voire qu’au bout de 5h l’apoptose n’a pas encore eu lieu alors qu’elle a eu lieu au bout de 15H Dans les cellules non inhibées, on n’observe bien la présence de CDC25A. Dans les cellules ayant été incubées 5h avec l’inhibiteur, on observe une accumulation de CDC25A traduisant sa non dégradation par le protéasome inhibé. Dans les cellules ayant été incubées 15 avec le protéasome, on observe la disparition de CDC25A et l’apparition d’un produit de clivage, d’une taille de 33kDa. Ce fragment correspond à la partie C-ter de CDC25 puisque c’est un Ac dirigé contre la pertie C-ter de CDC25 qui a permis de révéler le blot. Les memes résultats sont observé dans le cas d’une apoptose induite avec la lactacistin, qui est en inhibiteur plus spécifique du protéasome. Les chercheurs se sont donc demandés si le clivage pouvait être induit par d’autres inducteurs de l’apoptose…que les inhibiteurs du protéasome. Durant l’apoptose, CDC25A est clivé Libération d’un fragment C-ter de 33kDa

Le clivage dépend-t-il du signal apoptotique? Apoptose induite par Stau et MG Pour répondre à cette question, les chercheurs ont donc testés les effets d’un autre inhibiteur: la staurosporine= inhibiteur à spectre large des kinases. Pour cela ils ont incubé les cellules en présence ou non de stau puis ont réalisé une immunoprécipitation de CDC25A suivie d’un immunoblot avec des Ac contre la partie C-ter de CDC25A.On observe que là aussi le clivage de CDC25 a bien lieu et génère un fragment C-ter de 33kDa. Cependant ce produit du clivage semble plus abondant dans le cas de l’apoptose induite par inhibition du protéasome. Ils ont donc émis l’hypothèse que le clivage de CDC25A pourrait être influencé par l’activité du protéasome. Pour tester cette hypothèse, ils ont traité les cellules avec du TNFalpha pour induire l’apoptose, puis ils ont rajouté l’inhibiteur de protéasome pendant les 2dernières heures d’incubation. Hypothèse: Le clivage de CDC25A pourrait être influencé par l’activité du protéasome Produit du clivage plus abondant dans le cas de l’apoptose induite par inhibition du protéasome

L’intensité du clivage est-elle influencée par l’activité du protéasome? L’intensité du clivage semble augmenter lorsque le protéasome est inhibé Pour tester cette hypothèse, ils ont incubé les cellules avec du TNFalpha pour induire l’apoptose, puis ils ont rajouté l’inhibiteur de protéasome pendant les 2dernières heures d’incubation. Ils ont ensuite immunoprécipité CDC25A puis réalisé un imminoblot avec des Ac dirigés contre la partie C-ter de CDC25A. On observe que les cellules non inhibées possèdent bien CDC25A entier. Lorsque TNFalphe est l seul inducteur de l’apoptose, le clivag a bien lieu et le fragment C-ter est généré.. En ravanchel’inhibit Sachant le protéasome impliqué dans la dégradation de CDC25A en réponse e un stress génotoxique, ils ont voulu tester si une apoptose génotoxique pouvait induire la clivage, et générer le fragment C-ter. Hyp: l’activation CDK2 durant l’apoptose passe par l’activation de CDC25 et l’inactivation de p27kip1 par les caspases L’implication de CDC25 comme régulateur positif ou négatif de l’apoptose est très controversé L’activation de CDK2 est impliquée dans l ’apoptose induite par C myc. Le role de CDK2 activé dans l’apoptose n’est pas clair. Implication dans l’apoptose et L’activité du protéasome influencerait l’intensité du clivage de CDC25A 9

Cas d’une apoptose génotoxique Etoposide= inhibiteur de la topoisomérase II Dérégulation de CDC25A Pas de clivage Le clivage de CDC25A n’a lieu qu’en apoptose non génotoxique Ils ont donc induit une apoptose génotoxique avec l’étoposide (inhibiteur de la topoisoméraseII) et en ont observé les effets sur le clivage de CDC25A. On observe que CDC25A est bien présent dans les cellules où l ’apoptose n’a pas été induite. En revanche ni CDC25A ni le fragment C-ter ne sont observés dans les cellules ayant subi l’apoptose génotoxique. Cette drogue provoque donc une dérégulation complète de CDC25A mais ne provoque pas son clivage. CDC25A est donc régulé de façon différente en conditions génotoxique et non génotoxique CDC25A est régulé de façon différente en conditions génotoxiques et non génotoxiques

En conditions d’apoptose non génotoxique, CDC25A est-il dégradé par le protéasome? Etat d’activation de Chk1 Sachant que pour être dégradé par le protéasome, CDC25A doit être phosphorylée par Chk1, ils ont voulu regarder si les apoptose induites par STS, MG ET TNF, capables de provoquer le clivage passaient par cette même voie. Pour cela, incubation des cellules avec les inducteurs de l’apoptose puis immunoP de chk1 suivie d’un immunoblot avec Ac anti Serine phosphorylée. Comme attendu,on observe une activation de Chk1 sous traitement avec l’étoposide alors qu’aucune activation n’es observée avec les inducteurs de l’apoptose MG, Stau, TNFalpha…capables de générer le clivage.  L’apoptose non génotoxique induit le clivage de CDC25A, indépendamment de la voie du protéasome. L’apoptose génotoxique induite par l’Etoposide est bien médiée par l’activité de Chk1 L’apoptose non-génotoxique n’est pas médiée par l’activité de Chk1 L’apoptose non génotoxique induit le clivage de CDC25A, indépendamment de la voie du protéasome

Le clivage dépendent-il des caspases? Z-VAD Z-DEVD Inhibiteurs des caspases Pour répondre a cette question, ils ont voulu tester les effets des inhibiteurs des caspases sur le clivage. Ils incubé les cellules en présence ou non de staurosporine, puis les ont stimulées avec des inhibiteurs des caspases. Ils ont réalisé une immunoprécipitation de CDC25A suivie d’un imminoblot avec des Ac dirigé contre la partie C-ter de CDC25A Pour les cellule non inhibées, lorque l’apoptose est induite par Stau,on observe le fragment. En ravanche, les cellules inhibées en apoptose ne gén-rent pas le fragment. DONC CO0NCLUSION  Dans l’apoptose non genotoxique le clivage est caspase-dépendant

Où les caspases clivent-elles CDC25A? 2 sites de clivage possibles: ? CDC25A Dans une expérience préalable, non montrée ici, ils ont identifié 2 sites de clivages capables de générer des fragments de 33kDa. Ce sont les positions de clivage D216 et D223. Pour savoir au quel des ces 2sites clive la caspase 3, ils ont réalisés des mutants pour ces différents sites, ainsi qu’un double mutant pour les 2 sites. Ils ont ensuite incubé ces cellules en présence ou non de la caspase3. Ils ont réalisé une immunoprécipitation de CDC25A suivie d’un imminoblot avec des Ac dirigé contre la partie C-ter de CDC25. On observe qu’un clivage de CDC25A a bien lieu chez le WT et que le fragment généré est bien le fragment C-ter (c’est la même bande que celle observée chez les mutants qui surrexpriment le fragment C-ter) Aucun clivage n’est observé pour les mutants du site D223. DONC CONCLUSION Fragment C-ter (33kDa)  La caspase 3 clive CDC25A dans la position D223 et génère ainsi le fragment C-terminal (33kDa)

Quel est l’activité enzymatique du fragment C-ter généré? Test de l’activité phosphatase: Pour répondre à cette question ils ont testé l’activité phosphatase de CDC25A. Ils ont utilisé un substrat synthétique le la phosphatase, capable d’emettre de la fluorescence lorsque la déphosphorylation a bien eu lieu. Le fragment porte l’activité phosphatase, et cette activité est plus importante que chez le sauvage Le fragment C-ter de CDC25A a une activité phosphatase Cette activité est plus importante que CDC25A entier

Dans quel compartiment se localise le fragment C-ter de CDC25A? CDC25A est clivé dans le noyau Le fragment C-ter se localise dans le noyau

Quelle est la cible nucléaire du fragment C-ter? Déphosphorylation activatrice Sanchant CDC25A impliqué dans l’activation de CDK1 et CDK2 au cours du cycle cellulaire, les chercheurs ont testé ces 2 kinases comme cibles potentielles du fragment P33. Pour cela ils ont incubé les cellules avec un inducteur de l’apoptose. Ils ont ensuite réalisé une immunoprécipitation de CDK1 et CDK2 suivie d’un immunoblot avec des Ac dirigés contre la P-Tyr15…pour visualiser l’état d’activation des cibles CDK. Au cours du temps, Une déphosphorylation de CDK2 est observée, traduisant ainsi son activation par le fragment C-ter. En revanche, une augmentation de la phosphorylation de CDK1 est observée le fragment C-ter est donc impliqué dans la régulation de l’activité CDK1 et CDK2 Le fragment C-ter régule l’état d’activation de CDK1 et CDK2

Y-a-t-il une association directe entre le fragment C-ter et CDK2? Pour répondre à cette question ils ont incubé les cellules avec un inducteur de l’apoptose pendant 5 ou 15h. Ils ont ensuite réalisé une immunoprécipitation de CDK2 suivie d’un immunoblot avec des Ac dirigés contre le fragment C-ter. 15h après avoir induit l’apoptose, on observe la présence du fragmenttraduisant la présence d’un complexe Cter-CDK2 Le fragment C-ter et CDK2 forment un complexe pendant l’apoptose

Quelle est le rôle de CDC25A pendant l’apoptose? Aux vues des résultats précédents…on se demande quel est le role de CDC25A pendant l’apoptose. Ils ont utilisé l’annexine5 comme marqueur quantitatif de l’apoptose. Ici en ordonnée, on observe l’augmentation de l’apoptose par rapport au contrôle….pour les différents types cellaires qui sont: -les cellules exprimant CDC25A entier _les cellules exprimant CDC25A inactif _les cellules surrexprimant le fragment Cter _les cellules surexprimant le fragment Cter inactif Les cellules résistantes au clivage des caspases. Sans clivage, il n’y a presque pas d’apoptose induite….ce qui prouve que l’apoptose induite dans les cellules sauvages est due au clivage de CDC25A. Ce la est confirmé par la forte apoptose induite par le fragment tout seul. L’activité phosphatase du fragment est necessaire pour induire l’apoptose …car lorsque la partie catalytique est inactive, l’apoptose est diminuée. L’apoptose induite est due au clivage de CDC25A Le fragment C-ter induit l’apoptose de façon efficace L’activité phosphatase est nécessaire à cette fonction

Quelle est le rôle de CDC25A pendant l’apoptose? Microscopie à immunofluorescence: Dans les cellules qui surexpriment la fragment Cter, il y a colocalisation de la caspase3 et de CDC25A…alors que la forme inactive du fragment ne provoque pas cette colocalisation. Une surrexpression du fragment induit l’activation de la caspase3le fragment est capable de réguler le clivage  L’activité du fragment C-ter est capable de réguler le clivage

Conclusion CDC25A est clivé en réponse à différents stimulus apoptotique non génotoxiques Le clivage de CDC25A est caspase-dépendant et s’effectue au niveau du résidu D223. Il génère un fragment C-ter de 33kDa qui porte l’activité phosphatase. Ce fragment C-ter est destiné au noyau et a pour cible CDK2 dans les cellules apoptotiques L’activation de CDK2 par le fragment C-ter peut induire l’apoptose Le fragment C-ter régule le clivage de CDC25A

Conclusion CDC25A APOPTOSE C-ter Clivage Caspase-dépendant L’induction de l’apoptose dans ces cellules induit un clivage caspase dépendant générant un fragment C-ter actif impliqué dans l’activation de CDK2

Discussion Le fragment pourrait être issu d’un processus de maturation ou de dégradation CDC25A est un régulateur positif et négatif de l’apoptose. CDC25A C-ter En discussion, ils se sont demandé quel était l’origine du clivage et ont émis l’hypothèse que le fragment pourrait être issu d’un processus de maturation ou de dégradation. Il y a des arguments pour les deux hypothèses…et ils n’ont pas pu répondre à la question. ………. sachant que CDC25A est impliqué aussi bien dans la prolifération que dans l’apoptose, il serait interassant de connaitre quels sont les éléments qui interviennent dans ce choix. ? ?

Régulation de CDC25A par régulation d’un substrat encore inconnu Discussion Prolifération cellulaire Régulation de CDC25A par régulation d’un substrat encore inconnu ? CDC25A -P C-ter Mise en évidence d’une communication des voies d’apoptose non génotoxique et des voies de prolifération -P APOPTOSE