ECOLE NATIONALE VETERINAIRE T O U L O U S E Critères bactériologiques d’action des antibiotiques : les concentrations critiques Pour aller sur notre site si vous avez récupéré nos dia ailleurs Update mars 2012 P.L. TOUTAIN

Pharmacodynamie des antibiotiques Paramètres in vitro d’efficacité Paramètres in vivo d’efficacité

Indicateurs d’action & d’effet des antibiotiques In vitro: critères bactériologiques Statiques CMI, CPM, .... Prise en compte du temps EPA Dynamiques vitesse bactéricide in vitro & in vivo : indices mixtes PK/PD AUC/MIC, Cmax/MIC, Temps au dessus de la CMI In vivo bactériémie, hyperthermie, leucocytose, GMQ, survivants/décès, évolution des flores ...

Critères bactériologiques 1-In vitro & statique Buts Établir le niveau de sensibilité des pathogènes à l’antibiotique (mesure de puissance de l’antibiotique) Concentration minimale antibactérienne (CMA) Concentration minimale inhibitrice (CMI) Concentration minimale bactéricide (MBC) Prévenir le développement d’une population de mutants résistants Concentration préventive de mutants (CPM) PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

CMA : Concentration Minimale Antibactérienne • Concentration inférieure à la CMI entraînant les premières modifications morphologiques ou physiologiques de la bactérie ex. : production d'enzymes autolytiques / attachement in vivo/ accélération de la phagocytose

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse 1-La CMI PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

CMI ( Concentration Minimale Inhibitrice): définition Plus petite concentration (mg/L) capable, in vitro , d'interdire une croissance bactérienne pendant 24h mesure effectuée avec un inoculum de départ de 105 / ml Concentration bactériostatique Evalué indirectement en utilisant les antibiogrammes

Détermination de la CMI Méthode de dilution en milieu liquide (macrométhode avec des tubes ou microméthode avec des cupules) Méthode de dilution en milieu solide E-test (diffusion sur disque) Détermination avec des automates

Détermination de la CMI par une méthode de dilution en milieu liquide préparation d’une série de tubes à hémolyse avec le milieu de culture liquide (2 mL) pour constituer une gamme de concentrations de l'antibiotique à tester (ex: 0.5 1, 2, 4, 8, 16 µg/mL c.a.d selon une progression géométrique de base 2. Un tube (contrôle) servira de témoin de croissance de la souche à tester. On ajoute la même quantité de germes dans chacun tube (inoculum: 5 x 106 / ml). La galerie préparée sera incubée à 37°C pendant 18 heures. lecture à l'oeil nu

Détermination de la CMI 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 CMI CMI : Concentration dans le premier tube pour lequel il n'y a pas de croissance visible après 24h à 37°C

Détermination de la CMI Broth dilution

E-test

E-test : principe Un gradient de concentrations d'antibiotique est obtenu sur une bandelette plastifiée. La bandelette (une bandelette par antibiotique) est déposée à la surface d'une boite de Pétri ensemencée avec la suspension de la bactérie à tester

E-test :lecture Après un nuit d'incubation à 37°C dans une étuve, on peut lire directement la valeur de la CMI au niveau de la zone à lire.

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse E-test Avantages mesure plus précise de la CMI qu'avec un disque Utilisé en MH pour des infections sévères ou pour certains germes En MV, devrait permettre de s’affranchir de la principale limite de l’antibiogramme qui est la valeur des breakpoints retenus qui sont ceux de la MH Limites Cher et long à réaliser et non validé en MV par les organismes normatifs PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

Difficultés dans la détermination de la CMI P.Lees

Difficulté dans l’évaluation d’une CMI liée à l’hétérogénéité du prélèvement qui peut être constitué d’un mélange de germes ayant des CMI différentes

Sensibilité in vitro à l’amoxicilline et la gentamicine de 20 isolats différents de E Coli provenant du même prélèvement On notera l’hétérogénéité des résultats suggérant que la population responsable de l’infection n’est pas homogène mais se présente plutôt comme un « essaim » avec des germes ayant des CMI individuelles allant de 1 à 10

Difficultés dans l’évaluation d’une CMI liées aux aspects techniques de la mesure de la CMI

Le pas de dilution (1, 2, 4, 8…) donne une progression géométrique La vraie CMI est inférieure à celle qui est annoncée; elle est située entre le premier tube ayant une absence totale de croissance et le précédent Biais potentiel de 100%

Influence des conditions in vitro d'évaluation sur les résultats Effet inoculum (faible) pH CO2, O2 Amino-acides ....... Nécessité d'une standardisation des essais pour garantir leur reproductibilité (CLSI)

influence du pH sur l’action des antibiotiques x 40 30 20 6 7 8 pH Zone diameters (mm) Chlortétracycline Streptomycine Lorian, p35

Limite de la CMI : sa valeur dépend de la taille de l’inoculum PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

L'effet inoculum sur la détermination de la CMI - Certains AB (Bêtalactamines, Quinolones ) ont leur activité réduite en présence d'une population bactérienne importante (ce qui est le cas lors d’infection) - in vivo , on peut atteindre des densités de 1010 - 1011 UFC alors que les CMI sont mesurés à 105 UFC - Importance de commencer rapidement une antibiothérapie (métaphylaxie)

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Objectives: To determine the relationship between the density of bacteria (St Aureus) and the PD of 6 antibiotics (ciprofloxacin, gentamicin, vancomycin, linezolide..). Methods: In vitro time–kill, MIC estimation & PK/PD simulations Results: Inoculum effects on efficacy for all 6 antibiotics (density-dependent declines in the rate and extent of antibiotic-mediated killing and increases in MIC). PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse MICs estimated with different inoculmum densities, relative to that MIC at 2x105 Ciprofloxacin Gentamicin Linezolid Daptomycin Oxacillin Vancomycin PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Conclusions: PK/PD indices would be more predictive of the efficacy of antibiotics if, instead of using conventional estimates of the MIC, density dependent functions of MICs were employed as the denominators of these PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

Effet matrice sur la détermination de la CMI sérum Lait Exsudat Urine Bile LCR

MIC: serum vs. lait Staphylococcus aureus Nécessite 4 fois plus d’antibiotique pour être inhibé dans le lait que dans le plasma

CMI: Action des antibiotique in vivo vs in vitro

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Différences entre les conditions in vitro et in vivo pour déterminer une CMI In vitro Concentrations statiques pH physiologique, conditions optimales pour la croissance Milieu sans protéine, tout l’antibiotique étant libre Évaluation arbitraire à 24 h Pas de système immunitaire Inoculum de faible taille et constant In vivo Concentrations variables Conditions de croissance variables et limitation possible à la croissance Présence de protéines réduisant la fraction libre Évaluation possible in vivo mais pas à un temps prédéterminé Système immunitaire coopératif Inoculum de taille variable PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

Action des antibiotiques in vivo vs in vitro (ex : un abcès) • Acidité de l'abcès • Anaérobie • Conditions différentes de la périphérie au centre • Populations bactériennes variables en taille et en vitesse de croissance • Peut contenir une population mixte • Inactivation possible des aminoglycosides et des sulfamides

Utilité et usage des CMI Thérapeutiques sélection rationnelle d'un antibiotique Epidémiologiques surveillance des résistances

La CMI est considérée comme une bonne approximation de la concentration libre d’antibiotique qu’il est nécessaire d’obtenir au site d’infection pour éradiquer un pathogène C’est la raison pour laquelle les concentrations plasmatiques des antibiotiques sont « comparées  » aux CMI des pathogènes extracellulaires (pour les intracellulaires, cela est différent)

La CMI est le critère PD retenu dans la construction des indices PK/PD d’efficacité T>MIC AUC/MIC Cmax/MIC

Utilisation des CMI à des fins épidémiologiques Pour avoir accès a la base européenne des CMI des différents pathogènes et pour les différents antibiotiques ( y compris certains antibiotiques d’usage strictement vétérinaire), pour connaître les valeurs critiques des antibiogrammes (S/I/R) , etc. aller sur le site Eucast2

Distribution des CMI de la gentamicine pour E Coli (population sauvage)

La CMB

CMB : Concentration minimale bactéricide Plus petite concentration (mg/L) capable, in vitro , d'entraîner une inhibition irréversible de la croissance bactérienne (mort bactérienne) En pratique, éradication de 99.9% (3 log) d'un inoculum bactérien (106) en 18 - 24h

Détermination de la CMB Tous les tubes sont ensemencés avec la culture du tube ayant donné la CMI (tube non stérile) Recroissance Pas de recroissance 4 8 16 32 64 CMI CMB CMB : Concentration dans le premier tube repiqué avec la culture du tube de la CMI pour lequel il n'y a pas de recroissance visible (correspond au premier tube stérilisé)

CMB : Concentration minimale bactéricide La bactéricidie s'effectue selon des dynamiques temporelles variables et pertinentes à connaître On préfère évaluer la vitesse de bactéricidie à la CMB

Rapport CMB / CMI • Phénomène de tolérance : si R > 32 • Antibiotiques bactériostatiques vs bactéricidies (bactéricides si CMB = CMI)

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse 3-La CPM PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Concentration préventive de mutants (CPM) & notion de fenêtre de sélection : la concentration à prendre en compte pour prévenir l’émergence de résistance (surtout pour des quinolones) This lecture was prepared on April 5, 2003. Literature cited is listed as a note to the last slide. PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse

Hypothèses traditionnelles l’émergence de résistance Concentration CMI Pression de sélection pour les concentrations inférieures à la CMI; temps

CMP: le problème Dans un large inoculum, il est probable d’avoir une ou plusieurs sous-population à CMI plus élevée que la majorité du reste de la population à cause du taux spontané des mutations (ex: 10-5) La sous population à CMI élevée sera sélectionnée lorsque que la population mixte est exposée à des concentrations en antibiotique supérieures à la CMI de la population sauvage (qui sera alors éradiquée) mais inférieures à la CMI de la sous-population ayant mis en place un mécanisme de résistance (qui sera la seule à pouvoir se développer) et qui sous la pression de sélection de l’antibiotique finira par devenir la population dominante

Hypothèses actuelles sur l’émergence de résistance: dynamique des populations bactériennes

CPM (Concentration Préventive de Mutants) La CMP est la CMI de sous population(s), qui dans un large inoculum, a mis en place les premiers mécanismes de résistance En pratique, c’est la concentration prévenant le développement d’un inoculum de taille 109_1010 La méthode de détermination est la même que la CMI mais l’inoculum passe de 105 à 109 _1010

Notion de fenêtre de sélection CPM (Concentration préventive de mutants) (pour inhiber la croissance de la sous population ayant faut un premier saut mutationnel CMI (pour bloquer la population sauvage) Fenêtre de sélection des mutants Plasma concentrations Inhibition de toutes les Bie Croissance de la seule sous population mutante Croissance de toutes les Bie

La fenêtre de sélection La CMI et la CMP définissent une gamme de concentrations nommées fenêtre de sélection C’est la différence entre la CPM et la CMI

Notion de fenêtre de sélection

La fenêtre de sélection La fenêtre de sélection est la gamme des concentrations en antibiotique située entre la CMI et la CMP In vivo, la taille des inoculums étant élevées, on suspecte la présence de sous-populations à CMI plus élevées et qui seront sélectionnée si l’exposition à l’antibiotique est suffisante pour éradiquer la population sauvage mais insuffisante pour éradiquer la sous population résistante (mécanisme de sélection de résistance pour les quinolones) On doit fermer la fenêtre de sélection en choisissant des schémas posologiques garantissant des concentrations supérieures aux CMP (souvent 5 fois la CMI)

Les mutants ne sont pas sélectionnés en dessous de la CMI et au dessus de la CPM

Les indices de prévention des mutants Rapport MPC/CMI (définit la largeur de la fenêtre de sélection) De 4 à 8 pour les quinolones et pour le triméthoprime; 16 pour la doxycycline (MRSA); Temps passé dans la fenêtre de sélection (voir le chapitre consacré à ce sujet)

Stratégies pour limiter le développement de résistance Rester au dessus des CPM Posologies adéquates (one shoot; AUC/MIC=250h) réduire l’étendue de la fenêtre de sélection Objectif de développement pour l’industrie. Traiter les animaux en métaphylaxie Faible inoculum avoir recours à des associations intelligentes d’antibiotiques (tuberculose chez l’homme).

Stratégies pour limiter le développement de résistance: posologie adéquate Posologie pour que les concentrations plasmatiques libres passent au dessus de la CPM (toutes les bactéries seront éradicables) CPM CMI Concentration plasmatique Temps post-administration

Nécessité de réviser les schémas posologiques AUC/MIC > 125 h Garantir une AUC/MIC>125h veut dire que l’on garantit que la concentration plasmatique moyenne sur l’intervalle de dosage est 5 fois la CMI (voir la présentation des indices PKPD) Avec une AUIC/MIC de 250h (10 fois la CMI) on observe une éradication bactérienne très rapide (environ 2 jours) Application vétérinaire: « one shoot » Nécessité de réviser les schémas posologiques

Fermer la fenêtre de sélection Stratégies pour limiter le développement de résistance: fermer la fenêtre de sélection Dose au dessus de la CPM Fermer la fenêtre de sélection CPM Concentration plasmatique CPM~CMI CMI Innovations pharmaceutiques pour avoir le plus petit rapport entre la CPM et la CMI; cela permet d’avoir des posologies plus faibles pour éradiquer les mutants Temps post-administration

Valeurs des CMI & CPM pour les quinolones vétérinaires sur E coli et Staph aureus

Emergence vs. sélection de mutants résistants par les quinlones Les quinolones peuvent favoriser l’émergence ou la sélection de mutants résistants Pour de faibles concentrations (inférieures aux CMI), ils augmentent le taux de mutations et partant l’apparition de mutants. Stimulation du système SOS génère des hypermutateurs Pour les concentrations situées dans la fenêtre de sélection, ils sélectionnent les mutants dejà présents

Objectifs thérapeutiques liés à la fenêtre de sélection

Antibiotiques pour lesquels le concept de fenêtre de sélection s’applique Quinolones Bêta-lactams Macrolides Tétracyclines

Évènement sans sélection Résistance à la colonisation par Serratia liquefaciens () multirésistante in vivo dans le tube digestif de souris à flore humaine [E. coli ()]. Inoculation de S liquefaciens Ampicilline dans l’eau de boisson Log CFU/g of feces Sélection Amplification Évènement sans sélection Days From Duval-Yflah Y. et al. IAI 1980; 28 :981

Stratégies pour limiter le développement de résistance: la métaphylaxie Disease health Antibiotic consumption Metaphylaxis (Control) Prophylaxis (prévention) Growth promotion Therapy High Pathogen load No Small PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse NA

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Stratégies pour limiter le développement de résistance: la métaphylaxie qui doit être vue comme un traitement très précoce curatif Population de simple mutants présente au début du traitement donc mutants sélectionnables 10-8 10-8 Pop sauvage 10-8 métaphylaxie Pas de mutants car l’inoculum initial au moment du traitement est trop faible pour avoir généré des mutants et donc pas de risque de sélection pop sauvage sensible

Quelles sont les concentrations pour prévenir la sélection de bactéries à sensibilité réduite? Beta-lactamines: Toujours rester au dessus de 4xMIC (mais 40-60% du temps >CMI pour efficacité) Aminoglycosides: Avoir au moins un pic de 8x MIC Fluoroquinolones: AUC/CMI > 200 et pic /CMI > 8